文档介绍：PCR 基因扩增
一、原理
1985 美国 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人建立了一种大量快速扩增特异 DNA 片段的系统，
称之为聚合酶链式反应（PCR, polymerase序列的
保守性，又要考虑简并性，既保证扩增产物的特异性，又尽量减少引物种类，引物 3′端几
个碱基尽量不要简并。引物以干粉形式运输。最好用 TE 重溶引物，使其最终浓度为 100µM。
TE 比去离子水好，因为水的 pH 经常偏酸，会引起寡核苷的水解。当然，如果担心 TE 对
于 PCR 的影响，不妨用 ddH2O。引物的稳定性依赖于储存条件，应将干粉和溶解的引物储
存在-20℃。注意：溶解之前先离心一下，防止一开盖就飞了。引物的浓度会影响特异性。
最佳的引物浓度一般在 到 µM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。
3、DNA 聚合酶的选择。
Taq DNA 聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，因为其缺少 3'到 5'外切核酸酶（校正）活
性。使用带有 3' 到 5' 外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。但是这些聚合酶的
产量比 Taq DNA 聚合酶低。在很多公司的手册中有对各种酶特性的描述。
4、Mg2＋浓度
镁离子影响 PCR 的多个方面，如 DNA 聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，
这会影响特异性。dNTP 和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最
佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含 200µM dNTP 的典型 PCR 起始
浓度是 （注意：对实时定量 PCR，使用 3 到 5mM 带有荧光探针的镁离子溶液）。在
多数情况下，较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。
为了确定最佳浓度, 可以用 -5mmol/L 的递增浓度的 Mg2+ 进行预备实验，选出最适的
Mg2+浓度。在 PCR 反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或
EDTA 等可能影响 Mg2+ 浓度的物质，以保证最适 Mg2+ 浓度。
5、dNTPs
高浓度的 dNTPs 会对扩增反应起抑制作用。将每种 dNTP 的浓度从 200µM 降低到
25-50µM 可以使扩增产物获得满意的产率。
6、KCl
标准浓度为 50 mmol/L, 对于较短片段可将其提高到 70-100 mmol/L.
（二）、PCR 反应参数