文档介绍：一种筛选蛋白激酶a抑制剂高通量筛选方法
一种筛选蛋白激酶a抑制剂高通量筛选方法
本发明发现了一种筛选蛋白激酶A抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤：(1)蛋白激酶A抑制剂筛选模型的建立与优化：进行激酶浓度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实MPresponseelement,CRE)结合，从而激活CRE调控的基因转录。另 一方面，活化的PKA可以通过磷酸化Raf-1抑制其活化，封阻MAPK信号通路。因此，研究 PKA激酶抑制剂具有重大意义。
[0003] 时间分辨突光技术（time-resolvedfluorescence,TRF)是基于镧系元素如铕 (Eu)、钐（Sm)、镝（Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之 间距离小于l〇nm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均 相时间分辨突光（homogeneoustime-resolvedfluorescence，HTRF)技术是法国Cisbio 公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短（一般为几毫 秒），为了避免短暂的荧光干扰，Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能 量供体，受体经过别藻蓝蛋白（allophycocyanin)或突光素修饰，供体在能量转移时就可 以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消 失时间成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧 光引起的背景干扰。
[0004] 目前，已有多种PKA激酶抑制剂的筛选方法，多利用ELISA法来筛选PKA激酶抑制 齐[J，但是此方法费时费力，难以做到高通量筛选。因此，建立方便快捷准确的检测方法，特别 是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于建立一种基于均相时间分辨荧光的PKA激酶抑制剂高通量筛 选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
[0006] 本发明的技术方案：采用均相时间分辨荧光方法建立体外PKA激酶抑制剂高通量 筛选模型，初筛，复筛发现一类具有抑制PKA激酶活性的候选化合物。具体步骤如下：
[0007] 本发明利用均相时间分辨荧光的方法建立了一种PKA激酶抑制剂高通量筛选模 型。
[0008] 步骤一 ：PKA激酶抑制剂筛选模型的建立与优化。
[0009]步骤二：阳性药验证模型可靠性。
[0010] 步骤三：高通量筛选模型验证。
【专利附图】
【附图说明】：
[0011] 图1:PKA激酶浓度梯度优化实验结果。（n=3,[土W
[0012] 图2 :PKA激酶温孵时间优化实验结果。（n=3,;土
[0013] 图3 :PKA激酶底物浓度优化实验结果。（n=J,I土S)
[0014] 图4 :PKA激酶ATP浓度优化实验结果。（n=又^土S；
[0015] 图5:阳性药十字孢碱对PKA激酶的抑制曲线图。（n=3,;土S;
[0016] 图6 :PKA激酶抑制剂高通量筛选模型信号检测窗口。
[0017] 图7:高通量筛选Z'值分布。
【具体实施方式】
[0018] 以下结合【专利附图】
【附图说明】本发明的【具体实