文档介绍：一种筛选组织蛋白酶b抑制剂高通量筛选方法
一种筛选组织蛋白酶b抑制剂高通量筛选方法
本发明发现了一种筛选组织蛋白酶B抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤：(1)组织蛋白酶B抑制剂筛选模型的建立与优化：通过实验确定组织蛋白酶B最适浓度与反应优化。
[0007] 步骤二：阳性药验证模型可靠性。
[0008] 步骤三：高通量筛选模型验证。
【专利附图】
【附图说明】：
[0009] 图1:组织蛋白酶B浓度梯度优化实验结果。（n=3, [土幻
[0010] 图2:组织蛋白酶B温孵时间优化实验结果。（n=3,;土
[0011] 图3 :阳性药对组织蛋白酶B的抑制曲线图。（n=3, ;土^
[0012] 图4:高通量筛选Z'值分布。
【具体实施方式】
[0013] 以下结合【专利附图】
【附图说明】本发明的【具体实施方式】：
[0014]
[0015] ⑴实验材料
[0016] CathepsinB(Calbiochem?,Germany) >Z-Arg-Arg-7-amid〇-4-methylcoumari n hydrochloride(Arg-Arg-7-AMC)、L-Cysteine hydrochloride monohydrate reagent grade(L-cys)、30%BrijL23、亮抑酶肤（leupetin)、EDTA(Sigma-Aldrich?,USA)、去离子 水，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾和其它化学试剂均为国产分析纯、384孔黑板（Coming,USA)、 枪头（Axygen，USA)
[0017] ⑵实验步骤
[0018] (1)最适酶浓度与反应时间确定
[0019]-cys工作溶液，每孔加27ill。
[0020] b?用0? 1 %BrijL23配制不同浓度的2. 5XCathepsinB工作液，每孔加入36ii1， 使Cath印sinB的终浓度为1，
0. 5,0. 25,0. 125,0. 0625,0iig/ml。
[0021] (%81^_123稀释底物母液，^的工作液。每孔27111， 快速加入。检测12min内，Ex348nM，Em440nM处的荧光强度，反应温度为40°C。对结果作 图，选取窗口大，酶用量小，并且反应时间较短的CathepsinB浓度为最适浓度，并选取能够 达到最大信号值80%的时间为反应时间。
[0022] (2)阳性药IC50检测
[0023]. 4mML-cys的缓冲液，用此缓冲液梯度稀释阳性 药Leupetin，每孔加入27y1。
[0024] %&^」\0&让印811^工作液，每孔加入36111，使其终浓度 为1Ug/ml;同样配制浓度为3. 33yM的底物工作液，每孔27iil，快速加入。
[0025]，Ex348nM，Em440nM处的荧光强度，反应温度为40°C。计算 LeupetinIC50〇
[0026] 2?数据处理
[0027] (1)根据