文档介绍：一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法
一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法
一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，包括以下步骤：1）配制实验试剂，2）细胞接种，3）电子烟烟液染毒，4）LDH测定二醇、丙三醇等保润齐U，导致电子烟烟液溶液密度
较大，无法准确移取体积进行染毒溶液的配制。因此，本发明中使用精度不小于万分之一的分析天平对电子烟烟弹液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液配制。电子烟烟液染毒浓度范围应覆盖为10mg/ml-120 mg/ml,应设置不少于7个非零染毒浓度。
[0008]2)细胞接种:本方法所用细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞。在考察电子烟烟液对CHO细胞系的细胞毒性时，需开展预实验，对细胞接种密度进行优化。向96孔板的每孔中加入100 μ L细胞悬液，按照优化好的细胞接种密度进行细胞接种，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100 μ I生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μ I细胞悬液，于37 0C >5% C02条件下培养24 h ；
3)电子烟烟液染毒:细胞培养至指数增长期后，吸去培养液，96孔板(除最外周36孔)每6孔为一组，分别设置正常对照组、7个不同剂量的电子烟烟液染毒组和LDH最大释放组(细胞中能释放出来的LDH最大量)，正常对照组和LDH最大释放组均每孔加入100 μ I的细胞培养基，电子烟烟液染毒组每孔加入100 μ I不同浓度的电子烟烟液染毒溶液，96孔板的最外周36个孔中选择其中6个孔作为培养基背景对照，再选择6个孔加入最高电子烟烟液染毒溶液作为染毒溶液背景对照，于37 °C、5% C02条件下培养24 h。
[0009]4)LDH测定:电子烟烟液对细胞染毒24h，染毒结束前15分钟，在最大释放量孔中加入5 μ I裂解液。染毒结束后使用250g离心力对细胞培养板离心5分钟，每孔移取50 μ I上清至透明96孔板，加入100 μ ILDH基质液，反应一段时间后，加入50 μ I终止液，使用酶标仪检测每孔在490 nm波长处的吸光值。
[0010]6)结果与分析
原始吸光值A:A = A490 nm A (染毒孔吸光度值)=6个平行孔的吸光度平均值 A (染毒溶液背景)=6个平行孔的吸光度平均值 A (培养基背景)=6个平行孔的吸光度平均值 A(空白对照组)=6个平行孔的吸光度平均值 A (最大释放组)=6个平行孔的吸光度平均值
【权利要求】
，其特征在于:包括以下步骤: 1)配制实验试剂: (1)LDH基质液的配制:-盐酸(Tris-HCl)缓冲液()配制LDH基质液，其中各成分及其终浓度分别为:乳酸锂5 X IO-2 mol/L、硝基氯化四氮唑(INT) —4 mol/L、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS) —4 mol/L、氧化型辅酶I (NAD) 10_3 mol/L, LDH基质液应在临用前配制； (2)细胞裂解液:20%的曲拉通100(Triton-100)； (3)终止液:4M的盐酸(HCl)溶液； (4)细胞培养基:溶剂为RPM1-1640培养基，其中胎牛