文档介绍：苯丙氨酸氨解酶基因 在大肠杆菌 BL21DE3中的表达
苯丙氨酸氨解酶简介
缩写PAL。是催化直接脱掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶。EC．4．3．1．5。是1961年J．Koukol，E．Conn在大麦中发现的。存在于高等NA及pET-28c质粒的酶切图谱分析后，选用各自都只有一个酶切位点并能显著区分正反插入方向的BamH I进行酶切鉴定。根据理论分析，经BamH I酶切后可能出现的二种情况如下：正向插入生成的二个片段大小预计应为337bp和7549 bp，反向插入分别为2194 bp和5692 bp（见图3）。四个重组克隆的BamH I酶切图谱见图2，lane 1, 3, 5, 7。由此可知，获得了3个正向插入重组克隆和1个反向插入重组克隆。
获取工程菌的过程
三、重组质粒测序：
重组表达质粒测序结果如图4所示，与设计时预期的完全相同。说明该重组质粒已正向插入目的基因，对阅读框架分析，完全肯定了该质粒能正确表达rPAL-1-cDNA。
获取工程菌的过程
重组子的转化
按文献，将质粒pUC19-rPAL-1-cDNA转化大肠杆菌DH5α，并加以扩增。根据文献在水稻苯丙氨酸氨解酶基因（GenBank/EMBL, Accession number: x16099）ATG下游131-112碱基段设计测序引物5' TGGATCTTGACCAGCGGCT 3'，对pUC19-rPAL-1-cDNA质粒进行反向测序。测序按Perkin Elmer公司推荐的BigDye标记终止碱基双脱氧法在ABI PrismTM310自动序列分析仪上进行。根据测序结果，在表达质粒pET-28系列中，选择与之相匹配的表达载体。
获取工程菌的过程
筛选与鉴定
用EcoR I酶将pET-28c从多克隆位点处切开，在其5'端用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）脱去磷酸，纯化后溶于双蒸水中备用。
用EcoR I酶切质粒pUC19-rPAL-1-cDNA，%琼脂糖凝胶电泳分离（80V 4 h），-1-cDNA条带，用透析袋法回收，经酚、***仿抽提，乙醇沉淀纯化，溶于双蒸水。
rPAL-1-cDNA与5'端脱磷酸之线性pET-28c连接重组成表达质粒，连接时取插入片段DNA与pET-28c DNA的摩尔比为3∶1。连接产物转化感受态大肠杆菌BL21DE3, 在含有卡那霉素的LB平板上,筛选出阳性克隆。
获取工程菌的过程
根据rPAL-1-cDNA及pET-28c酶切图谱，选用BamH I酶切重组质粒，鉴定插入方向。并用测序引物对重组质粒PET-28c-rPAL-1-cDNA进行测序，进一步确定其插入方向及阅读框架。
获取工程菌的过程
工程菌的诱导表达及SDS-聚丙酰***凝胶电泳分析：
挑取正向插入克隆，接种于含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养16 h,以1∶200比例接种于新鲜的含抗生素的培养基中, 37℃ h进行扩增,取100 mL菌液作为诱导前对照。然后加入终浓度为1 mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，在37℃振荡培养中诱导工程菌表达,分别于诱导1,3,5,7 h四时间点取样,以BL21DE3及经pET-28c空载体转化的BL21DE3为对照，在超声裂解液中将大肠杆菌超声破碎，200 W 10 s，停10 s，重复10次。4 ℃ 15 000 r/min离心15 min，上清液和沉淀分别进行10% SDS-聚丙酰***凝胶电泳(SDS-PAGE)，200 V，30 min，考马斯亮兰染色，结果经Kodak digital scienceTM电泳扫描仪分析确定其分子量及蛋白表达量。
结果
表达质粒pET-28系列的选择：
应用测序引物对质粒pUC19-rPAL-1-cDNA进行部分测序，结果见图1。从rPAL-1-cDNA序列中首先找出翻译起始密码ATG，根据3个碱基编码1个氨基酸的原则，由此往上推算可知，要求表达载体在EcoR I接头处的三联体结构必需具备与之相匹配的ATT框架。对比大肠杆菌表达质粒pET-28a, b, c部分序列，发现在重组后，能保持正确阅读框架，而不发生移码的只有pET-28c符合要求。若rPAL-1-cDNA正向插入pET-28c 多克隆位点上的EcoR I位点，预期重组后的表达质粒部分序列应如图1所示。
获取工程菌的过程
10% SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳及扫描分析：
以大肠杆菌BL21DE3和经pET-28c质粒转化的BL21DE3为对照，与经pET-28c-rPAL-1-cDNA 转化的BL21DE3在同等条件下按照方