文档介绍：临床基因扩增检验培训班-PCR污染与预防
56、死去何所道，托体同山阿。
57、春秋多佳日，登高赋新诗。
58、种豆南山下，草盛豆苗稀。晨兴理荒秽，带月荷锄归。道狭草木长，夕露沾我衣。衣沾不足惜，但使愿无违。
59、相见无杂言，但道桑麻长ation
Capture Probe linked to BSA
Step 3. Binding of a Av-HRP Conjugate and Addition of Substrate
(Incubate at 37 C)
Capture Probe
Magnetic Microparticles
Avidin-horseradish Peroxidase Conjugate
Biotin
Amplicon
Tetramethylbenzidine
(TMB) Substrate
MMP
MMP
TMB
Hydrogen
Peroxide
o
Step 4. Stop Solution Addition and Absorbance Measurement
Add Stop Solution and
Measure Absorbance
Capture
Probe
Microwell Plate
Addition
of Substrate
Tetramethylbenzidine
(TMB) Substrate
Biotin
BSA
AMPLICON
BSA
AMPLICON
Hydrogen
Peroxide
Avidin-horseradish peroxidase
(Av-HRP conjugate)
标准实验室的基本规章制度
所有进入ＰＣＲ实验室的人都要遵守该制度。
明确试验目的是否与实验室功能一致。
明确试验中的不确定因素。
物流和人流
单向流动的原则。
从“干净”的实验室到“脏”的实验室
工作服
(1)在实验室指定区域内更换指定的工作服。
(2)实验室中应频繁更换手套。
(3)一次性实验室用品(包括一次性手套与鞋套)应丢弃到生物危险废料容器中。
(4)工作衣不能穿出指定的实验室外。
实验室卫生
实验室设备必要时应用10%漂白剂清洗。
所有实验室废物均应按照生活垃圾、医用垃圾、尖锐状废料以及破碎的玻璃器皿进行分类，尤其是感染性废料必须高压消毒后方能丢弃。
防护罩/超净工作台
工作前，工作台表面应用75%酒精擦拭台面，紫外灯消毒，
工作后，把物品移出，用75%酒精擦拭台面，并打开紫外灯消毒。
几点建议
(1)所有试剂与样品准备过程中应使用一次性灭菌的管子与瓶子
(2)每次实验应设阴性对照.
(3)将标准品与阳性对照直接储存在标本处理区，标准品的稀释(管子离心后5min打开,以避免气溶胶的产生。不能剧烈振荡标准品与阳性对照)
(4)正确使用微量加样器
(5)定期用10%的次***酸钠清洁微量加样器与工作台面
(6)换气设备应正常工作.
三、酶法防止PCR产物的遗留污染
限制性核酸内切酶法。
修饰引物，使扩增产物被某种酶切割。
UNG消解法
UNG消解法原理
1）在PCR反应体系中加入UNG，并用dUTP替代dTTP，扩增产物含有dUTP 。
2）UNG可以去除遗留污染DNA中的dU， DNA聚合酶会在这些位点处停滞。
3）无dU的位点是热不稳定的，在热循环中会发生断裂。
以dUTP替代dTTP的PCR扩增产物，“ ”表示dUTP
再次扩增，扩增体系加入UNG，37度10分，可消去dU。
95度10分钟，DNA在无dU的区域断裂，
因此遗留的DNA不能被扩增
UNG消解法的缺点
短于100bp的PCR产物不能用UNG完全消除污染，
四、表面紫外线照射减少PCR污染的原理
紫外线(Ultraviolet、UV)诱导DNA的损伤是通过在相邻的嘧啶碱基(CT、TT、TC、CC)之间形成环丁烷环而发生的，环丁烷环形成链内的嘧啶二聚体，从而抑制了聚合酶介导的链延伸反应。
变性
退
火
5’
3’
5’
3’
5’
5’
5’
3’
3’
紫外线照射
延伸
5’
5’
3’
3’

特点
需要较长的时间，不能消除所有污染，
对序列长度有一定的依赖性，当DN***段小于300bp时效果较差。
被消毒表面应与UV光源垂直以达到最大的光强度。
靶分子被遮蔽，则失活效率不高。
UV照射具有致突变性，并可引起视力下降或致盲。
去污染方法
紫外灯在工作区不使用的所有时间内始终打