文档介绍：研究生实验二
BD ELISPOT 应用
移植研究
疫苗开发 -亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响
Th0/Th1/Th2细胞转换分析
自体免疫研究 – 免疫调节及免疫治疗研究
癌症研究 -肿瘤反应T细胞作用
研究生实验二
BD ELISPOT 应用
移植研究
疫苗开发 -亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响
Th0/Th1/Th2细胞转换分析
自体免疫研究 – 免疫调节及免疫治疗研究
癌症研究 -肿瘤反应T细胞作用
过敏机制探讨 – IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与过敏机制之细胞因子研究
传染疾病研究
体液免疫研究 – B细胞免疫球蛋白及特定亚型反应的进展研究
BD ELISPOT原理
，用来吸附特殊挑选、且无毒性（不含sodium azide、内***endotoxin）的单株抗体。
，再接受适当的抗原刺激，并将微孔板放置于温箱中过夜培养一段时间。一般而言，记忆性T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞因子，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞因子会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。
，被捕获的细胞因子可进一步使用 生物素（Biotin）标记的一抗来标识，其后再与辣根过氧化物酶标记的亲合素作用，并加入底物使其呈色，有反应作用的细胞会留下约10-20mm大小染色的斑点。
BD ELISPOT 流程
1．针对被分析物的 捕获抗体包被在贴有PVDF膜的微孔板上
2．用完全培养基将板底封闭
3．细胞悬液加入Ag或有丝分裂素等刺激剂孵育一定时间以激活细胞――细胞分泌的蛋白紧靠在细胞周围，与已固定的捕获抗体结合
4．孵育一定时间后洗去细胞,分泌出的细胞因子会被PVDF薄膜上特异抗体捕获
BD ELISPOT 流程
5．加入生物素标记的针对被分析物的检测抗体――检测抗体与被分析物结合，形成 ‘夹心三明治’复合物
6．加入与辣根过氧化物酶(HRP)连接的亲和素――亲和素与检测抗体上的生物素结合
，监测颜色斑点的形成，终止底物反应，室温风干，避光保存于封口塑料袋中直至分析颜色斑点
BD ELISPOT 流程
Coating Ab
包被培养板
%PBS-Tween20(PBST)
洗板5次
每孔加入1%BSA阻断
按实验设计
加入含或不含刺激剂的培养液
及一定数目细胞孵育5-24小时
40C过夜
370C孵育1小时
取外周血单核细胞
或脾淋巴细胞
根据实验要求，
培养液中加入
所需刺激物，
预先将所检测细胞
孵育24-42小时
无菌
直接取外周血
单核细胞或
脾淋巴细胞
或者
BD ELISPOT 基本流程
去除细胞，加入冰冻去离子水200ul/孔，
培养板置冰上10分钟
加入生物素标记
的detector Ab
加入酶标抗生物素抗体(GABA)
40C暗处混合显色剂I和II,
加入显色剂I/II,
暗处室温孵育20-30分钟
PBST洗板10次
370C孵育1小时后，PBST洗板5次
370C孵育1小时后，PBST洗板5次
显微镜下观察至斑点形成，
去离子水清洗培养板
室温干燥后
在倒置显微镜下观察结果
非无菌
ELISPOT 结果显示
ELISPOT 结果显示
Blank controls:
G1-9: 无刺激剂的细胞
H1-9: 无细胞的刺激剂
样本孔出现颜色斑点
Usu. 10～20 mm
BD ELISPOT 结果分析
在显微镜下计数，一个斑点代表一个分泌细胞
用Elispot Reader 进行分析对斑点自动计数，并做出不同大小斑点的分布图，快速、精确、还能平衡背景信号。
软件自动计算出细胞的分泌频率
BD ELISPOT 操作注意事项1
。
，在第一次实验时可使用不同的细胞浓度（103~106cells/microwell)。
，防止斑点模糊。
，不要将ELISPOT板重叠，防止边缘效应。
：
增加洗涤的次数。
在显色之前用PBS洗涤以去除Tween-20，防止对显色的干扰。
如果需要,增加干燥ELISPOT板的时间。
彻底洗去细胞减少非特异性斑点。
掌握好显色时间，防止过度显色。
，不能高于3