文档介绍：目的基因的 PCR 扩增及其扩增产物的鉴定分析综合性设计性实验-8 此实验共包括如下六个部分 ,目的基因选择 , PCR 引物设计 , PCR 实验操作 , PCR 产物电泳鉴定 , PCR 产物测序鉴定 ,目的基因序列变异分析第一部分,目的基因选择候选基因简介在本实验中,有三个候选基因,分别是 NGAL , Fascin 和 Ezrin 。这三个基因在食管癌及其他多种肿瘤中呈过表达,说明它们在肿瘤的发生发展中起重要的生物学作用。汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组曾对这三个基因进行了深入研究,在国外杂志上发表 SCI 收录研究论文 20余篇,已形成系列优势。同学们可查阅相关资料,选择感兴趣的基因来做 PCR 实验。 NGAL ( neutrophil gelatinase -associated lipocalin )即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白,是脂质运载蛋白( lipocalin ) 家族的一个成员。 NGAL 基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶-9的活性,作为小分子铁配合物结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能。另外, NGAL 作为一种早期标志物还可以帮助判定缺血性肾损伤程度。 NGAL 的 mRNA 信息在 NCBI 核酸数据库中有来自不同实验室登记的多个版本,包含完整编码区的有 BC033089 和 NM_005564 等,编码区长为 597 bp ,编码 198 个氨基酸,包含了N端前部长为 20个氨基酸的信号肽序列(为核酸序列的 1-60 bp )。 NGAL 基因 NGAL 核酸编码区序列及其相应的蛋白序列:前20个 AA 为信号肽序列 2001 年汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组以永生化食管上皮细胞系 SHEE 和食管癌细胞系 SHEEC 互为对照,用 cDNA 微列阵进行筛选,用 RNA 印迹和 RT- PCR 进行鉴定, cDNA 克隆测序后与 GenBank 进行 BLAST 分析比较。结果表明 NGAL 基因在 SHEEC 中出现显著差异过表达,其 cDNA 序列与小鼠 24p3 、大鼠 NRL ( neu -related lipocalin ) 和人中性粒细胞 NGAL 具有较高的相似性。这提示 NGAL 基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中可能发挥着重要作用,可能是一种新的癌基因或促癌基因。 AB利用 cDNA 芯片筛选两种细胞的差异表达基因 SHEE SHEEC A B C 反转录 PCR 检测 NGAL 在两种细胞的 mRNA 水平 SHEE SHEEC C. 100 bp DNA marker Fascin 蛋白的 mRNA 全长为 2767bp ,由 5‘端非翻译区 111bp 碱基, 3’端非翻译区 1174bp 碱基, 1482bp 的全编码序列区和 6个 PloyA 信号肽组成,编码 493 个氨基酸,分子量约为 55kD 。 Fascin 蛋白定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶(ruffles) ,边缘的丝状伪足( filopodia )、微棘( microspikes )的核心肌动蛋白束中。以往研究发现, Fascin 基因在许多上皮来源的肿瘤细胞系,如宫颈癌 Hela 、胃癌 AGS 、大肠癌 LM1215 和 SW480 、胰腺癌 BxPC3 和 T3H4 等细胞系中均上调表达。细胞的丝状伪足和微棘与细胞的运动,癌细胞的转移有密切关系,提示 Fascin 蛋白可能在细胞迁移、细胞粘附以及细胞间信息交流等过程中发挥作用。 Fascin 基因 TGAC TGAAGAAGAAGCAGATCTGGACGCTGGAG TGGCGGCGGACA TCATCGTGGCGCACGACGAC TGCTTCGC TGGGG TGC GGCAAGGT AACGA GGCG TCGGTGGAGA GCGGGGAGCATGGC AGCTGGAGTT A ATCAAGGTGGGCGGG TCGCTCTGGGA GTACTAG MTANGTAEAVQIQFGLINCGNKYLTAEAFGFKVNASASSLKKKQIWTLEQPPDEAGSAAVCLRSHLGRYLAADKDG NVTCEREVPGPDCRFLIVAHDDGRWSLQSEAHRRYFGGTEDRLSCFAQTVSPAEKWSVHIAMHPQVNIYSVTRKRYA HLSARPADEIAVDRDVPWGVDSLITLAFQDQRYSVQTADHRFLR