文档介绍：外周血单个核细胞分离
第1页，讲稿共19张，创作于星期日
实验原理
人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞。
单个核细胞的体积、形态和比外周血单个核细胞分离
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实验原理
人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞。
单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同。--泛影葡***（ficoll-hypaque）分离液作密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布,从而分离出PBMC。
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人血液中各种细胞的密度如下：
红细胞：
白细胞：
淋巴细胞和单核细胞：-
血小板：-
F/H= ±
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肝素抗凝全血+等量Hanks液
将F/H管稍倾斜
将稀释血液在距分层液界面上1 cm处沿试管壁缓慢加至分层液上面。
应注意保持两界面清晰，勿使血液混入分层液内。
Ficoll/Hypaque (2:1)
1500rpm, 20 min 水平离心
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血小板
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⒈ 简述补体的概念、分泌细胞及激活途径。
⒉ 简述补体的经典激活途径的具体过程。
⒊ 补体结合反应为什么需分两阶段进行？如果将
几种成分反应顺序颠倒，结果会如何？
⒋ 参加补体结合反应的各已知成分，为什么须预
先滴定？试验中所设计的四种对照管有何意义？
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用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离心管中。
将所得到的PBMC悬液用5倍体积的Hanks液或RPMI-l640洗涤2次，1500 rpm 5min。
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淋巴细胞浓度（细胞数/ml）=四个大方格内细胞数/4×104
细胞计数板
计数细胞, 调整细胞至所需浓度
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台盼蓝染色测定细胞存活率
台盼蓝（trypan blue）染色法是测定细胞活力的最简便的方法。
台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，它不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色。
细胞存活率(%)＝无色细胞数/细胞总数×100%
计数200个细胞，一般活性应在95％以上
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注意事项
，避免血源性传染病传染。
，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细胞活性及细胞丢失。
±；应避光4 ℃下保存，取出后逐渐升至室温后混匀，方可使用。使用中应避免细菌污染。
，提高淋巴细胞收获量，但如果要保留血浆成分作其他实验用时，则不能稀释血液，以免影响血浆成分。
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E玫瑰花环试验
Erythrocyte rosette formation test
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原理
T淋巴细胞表面有绵羊红细胞受体（CD2），不需要任何处理可与绵羊红细胞结合形成花环，B淋巴细胞和巨噬细胞无绵羊红细胞受体，因此形成E花环的细胞主要是T淋巴细胞。
计算外周血中E花环形成细胞的百分率，可从数量大致推测机体的细胞免疫状态。
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原理
T cells
SRBC
E- rosette
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E玫瑰花环试验
高倍镜下计数200个以上的淋巴细胞中花环形成细胞的百分数。
凡能结合三个以上SRBC者为花环形成细胞。
正常值：60-80%
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淋巴细胞功能检测—淋巴细胞转化试验
Detection of lymphocyte function：lymphocyte transformation test
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原理
指体外培养的淋巴细胞与特异性抗原或非特异性促有丝分裂物质