文档介绍：外周血单个核细胞的分离及活力测定
Isolation and storage of PBMC and viability test
实验原理
人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞。
单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同。--泛影葡***(ficoll-hypaque)分离液作密度梯度离心,离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布,从而分离出PBMC。
人血液中各种细胞的密度如下:
红细胞:
白细胞:
淋巴细胞和单核细胞:-
血小板:-
F/H= ±
肝素抗凝全血+等量Hanks液
将F/H管稍倾斜
将稀释血液在距分层液界面上1 cm处沿试管壁缓慢加至分层液上面。
应注意保持两界面清晰,勿使血液混入分层液内。
Ficoll/Hypaque (2:1)
1500rpm, 20 min 水平离心
血小板
⒈简述补体的概念、分泌细胞及激活途径。
⒉简述补体的经典激活途径的具体过程。
⒊补体结合反应为什么需分两阶段进行?如果将
几种成分反应顺序颠倒,结果会如何?
⒋参加补体结合反应的各已知成分,为什么须预
先滴定?试验中所设计的四种对照管有何意义?
用毛细吸管轻轻插入灰白色层,沿管壁轻轻吸出该层的单个核细胞,盛入另一支离心管中。
将所得到的PBMC悬液用5倍体积的Hanks液或RPMI-l640洗涤2次,1500 rpm 5min。
淋巴细胞浓度(细胞数/ml)=四个大方格内细胞数/4×104
细胞计数板
计数细胞, 调整细胞至所需浓度
台盼蓝染色测定细胞存活率
台盼蓝(trypan blue)染色法是测定细胞活力的最简便的方法。
台盼蓝又称锥蓝,是一种阴离子型染料,它不能透过活细胞正常完整的细胞膜,故活细胞不着色,但死亡细胞的细胞膜通透性增加,可使染料通过细胞膜进入细胞内,使死细胞着色呈蓝色。
细胞存活率(%)=无色细胞数/细胞总数×100%
计数200个细胞,一般活性应在95%以上