文档介绍：关于实验三重组质粒转化大肠杆菌
第1页，讲稿共21张，创作于星期日
实验目的
学****将重组质粒DNA导入大肠杆菌的方法
学****化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法
为下一步重组体筛选做准备
第2页LacZ）
复制起始位点
种类：
质粒
噬菌体
酵母人工染色体（YAC）
反转录病毒载体
表达载体等
第6页，讲稿共21张，创作于星期日
第7页，讲稿共21张，创作于星期日
pET-32a Vector
The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E. coli.
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pET-32 cloning/expression region
第9页，讲稿共21张，创作于星期日
Vector (pET-32a)
Gene fragment (SmPR10)
pET32a-SmPR10
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材料、设备及试剂
材料
E. coli DH5α菌株: R-、M-、Amp- (转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和***化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。）
pET32a-SmPR10质粒DNA（浓度：2 ng/μl): 实验室自制
设备
恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；超净工作台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。
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试剂 1、LB固体和液体培养基
LB培养基配方：（单位g/L）
胰蛋白胨 10
酵母提取物 5
NaCl 10
琼脂粉（%） 15g （注：LB液体培养基不加琼脂粉）
按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂，待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,。121℃湿热高压灭菌20分钟，待冷却至60℃左右,在超净工作台中加入一定量的Amp储存液,使终浓度为100μg/ml,摇匀后用培养皿铺板。
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2、Amp母液：
称取氨苄西林100mg溶于1mlddH2O中，，-20℃冰箱.
3、 CaCl2 溶液:
(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,。EP管分装于4℃冰箱储存 .
4、 pET32a-SmPR10质粒：实验室自制
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操作步骤
（一）受体菌的培养
1、取-70℃或-20℃贮存的大肠杆菌DH5α菌种，在LB培养液中培养过夜，进行活化;
2、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在LB平板上涂布,于37℃培养箱中培养24h；从LB平板上挑取单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
3、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝(生长对数期）。（注：这一步非常关键。培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA能力较低，从而导致转化率降低。）
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（二）、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、,冰上放置10分钟,然后于4℃、4000rpm离心10分钟。　
2、弃去上清,用预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液1ml轻轻悬浮细胞,冰上放置10分钟后,4℃、4000rpm离心10分钟。
3、弃去上清,. 1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞。每份100μl（注意悬液密度要均匀）,冰上放置备用。　
4、暂时不用的感受态细胞可置于 -80℃保存。
注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！
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（三）重组质粒DNA的转化
质粒和感受态细胞混和：在100μl感受态细胞悬液中加入5μl