文档介绍：荧光定量PCR
miRNA 与 siRNA的异同
分子形式无区别，都是由Dicer产生的~22nt小分子
分子功能近似，都导致目标基因表达水平下降，但通常siRNA效果更剧烈
产生来源不同
miRNA有其基因，内源性表达
s
5’
3’
SG
SG
SG
SG
5’
3’
5’
3’
SG
SG
SG
SG
Emission
Excitation
SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料。
SYBR Green I只与双链DNA结合才能发出荧光。
荧光信号的强度与反应体系中所有双链DNA分子成正比。
SYBR Green I 工作原理
Taqman 工作原理
在退火过程中，探针与靶序列结合
探针被Taq酶的5’- 3’ 外切酶活性剪切成片断
游离报告基团发出荧光
在延伸过程中，探针部分与靶序列分离
荧光信号强度与结合探针的DNA分子成正比。
染料法与探针法 对比
探针法
特异性高
-- 与探针与特异靶序列结合
对模板有选择性
-- 可进行多重PCR反应
成本高
-- 不同靶基因需要合成不同探针
染料法
通用性好
-- 对DNA模板没有选择性
使用方便，成本低
-- 仅需设计两个引物
有假阳性现象
-- 通过融解曲线判断
Real-time PCR 应用
基因表达分析
-- 相对定量：基因表达量的差异
-- 绝对定量：样本中核酸的量（拷贝数、微克）
基因型分析
-- SNP检测 等位基因检测 ***化检测
基因表达分析检测
test sample
处理样本
target gene
目的基因
reference gene
内参基因
total RNA
cDNA
calibrator sample
对照样本
target gene
目的基因
reference gene
内参基因
qPCR
以各自样本中内参基因为标杆，
比较两样本中目的基因的相对丰度。
数据分析
qPCR
cDNA
total RNA
内参基因的选择
特点
选择内参基因
内参基因
beta-actin、
GAPDH、
18S rRNA、
28S rRNA等
-- 文献检索
-- 实验筛选
选择多个备选内参基因，以备选内参基因的几何平均数作为均一化标准
内参基因Housekeeping Gene
-- RNA抽提、反转录为cDNA的效率不同，用于定量分析的样本初始浓度不同。
对样本初始浓度差异进行均一化校正。
不同环境，不同器官、组织、细胞类型之间，表达量相对恒定。
Housekeeping Gene 康为产品
不同丰度：
高丰度 ACTB、GAPDH
中等丰度 beta2M
低丰度 HPRT1
不同物种：
人、大鼠、小鼠、猪、牛、羊、鸡、斑马鱼、甘蔗 等
基因表达分析检测
样本处理与 RNA提取 – cDNA – qPCR
内参基因(housekeeping gene)选择
样本处理与RNA提取
外界刺激 – 10分钟 – 可检测的表达改变
样品离开定义环境 – 2分钟内 –固定、裂解细胞
RNA样本保存液
Trizol
超纯RNA提取试剂盒
RNA的评价与鉴定
- 完整性
- 纯度
小心DNA污染！ - 使用DNaseⅠ
- 引物设计
- 以RNA作PCR阴性对照
CW0580
CW0592
CW0581
CW2090A
RT-qPCR一步法还是两步法？
两步法：步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留，检测多个基因，便于反应条件的优化。
推荐：工作的初期阶段，以及单个样本多个靶基因检测。
一步法：简单、灵敏度高，有效减少实验操作误差和污染。每次只能做一个基因。
推荐：工作的成熟阶段，以及多个样本单个