文档介绍：细菌DNA提取方案
细菌DNA提取方案：革兰氏阴性菌，, 一般有三种可以选择的方法。
一、 水煮模板法一一主要用于PCR反应
1、 接种单菌落于LB或脑心平板，连续画线，37摄氏度培养18-24小时。
2、 刮取1〜22次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1xTE缓冲液中， 5mg/L的蛋白酶、 10% SDS，轻轻混匀后50°C放置3h〜5h,接着用等体积的Tris饱和苯 酚抽提2次，苯酚/***仿/异戊醇抽提一次，***仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA 沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1xTE或ddH2O中。
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1)细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37C摇床(300rpm)培养过液。2)细菌收集：取1ml培养物于 EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE()中(用ddH2O也行)。3)菌 体裂解：加入6^l 50mg/ml的溶菌酶，37C作用2h。再加2mol/LNaCl50pl，10%SDS 110山，20mg/ml的蛋白酶 K 3山，50C作用3h或37C过夜。(此时菌液应为透明粘稠液体)4)抽提： EP管，加等 体积的酚：***仿：异戊醇(25 : 24 : 1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。(上清很 粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去)5)沉淀：，混匀，室温放置10min。1 2000rpm 离心10min。6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。7)抽(凉)干后，溶于50山ddH2O中，取2-5^l电泳。作PCR 模板用。
4. DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL1) Grow cells overnight in 500 ml broth ) Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH ), 50 mM ) Freeze cell suspension at -20C4) Add ml 250 mM Tris (pH ), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and let thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 ) Add 1 ml % SDS, 50 mM Tris (pH ), M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place in 50C water bath for 60 ) Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15 min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if ) Add vol 3M