文档介绍：质粒DNA提取、鉴定
暨大医学院生化教研室
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质粒（plasmid）
存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，可在宿主细胞中自主复制，并在细胞分裂时传给子代。
与染色体ＤＮＡ相比，质粒结构简单，分子面划线接种于培养板。
2. 单克隆培养：挑取单个菌落，接种到培养瓶中， 37 ℃培养24 h。
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3. 扩大培养：培养液3 ml,接种于60 mL 的LB培养液（含Amp 50μg/ml),振摇200 rpm， 37 ℃(4-6 h), 使A580＝-。
4. 加氯霉素：加氯霉素，终浓度40 μg/ml，继续培养15-17h.
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本次实验用
碱裂解法提取DNA
包括：
1. 菌体收集
2. 菌体裂解、质粒DNA提取、纯化
3. 鉴定
2人一组
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原理：
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
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1. 取6 ml Eppendorf管， ml
↓ 9000rpm 2-3min
↓↘弃上清
2. 600 μl STE液依次溶解各管沉淀，合并一管
再用200 μl STE液清洗各管，清洗液合并一管（收集菌体）
↓ 9000rpm 2-3min ,弃上清
（保留菌体）
收集菌体
600ul
1 2 3 4 5 6
200ul
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3. 沉淀悬于200 ul溶液I，枪头吹打混匀
↓ 放置5 min
4. 加入400 ul溶液II，颠倒EP管20～30次（动作轻!！）
放置5 min
5. 加入300 ul溶液III，充分混匀（温和操作）
↓ 10 min
沉淀蛋白质和染色体DNA
裂解
碱裂解法提取质粒DNA
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溶液I
成分：50 mM葡萄糖/
25 mM Tris-Cl /
10 mM EDTA，pH ；
Tris-Cl溶液：控制溶液的p H，
50 mM葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
EDTA：是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长
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溶液II
成份： N NaOH / 1% SDS；
为保证NaOH不因吸收空气中的CO2而减弱其碱性，最好用新鲜的浓NaOH稀释后和2％的SDS等体积混合后使用的。
NaOH：溶解细胞。之所以叫碱裂解法，即是因为NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，都会在瞬间溶解，细胞从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化。
SDS：结合蛋白，平均两个氨基酸结合一个SDS分子，
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加溶液II要记住两点：
1. 时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；
，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会混入质粒DNA中，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。
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溶液III
成份： 3 M醋酸钾/ 2 M醋酸
3 M醋酸钾：SDS十二烷基硫酸钠遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate，PDS），而PDS是不溶的，溶液III加入使钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，SDS结合了大量蛋白质，PDS就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，
2 M的醋酸：中和NaOH，长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。
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12000rpm 3min
↓↘