文档介绍：现代微生物学实验技术
谢响明 教授
北京林业大学
生物科学与技术学院
利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性
实验目的
1. 了解利用基因工程技术在大肠杆菌中表达外源蛋白
的原理；
2. 掌握SDS-PAGE的原理现代微生物学实验技术
谢响明 教授
北京林业大学
生物科学与技术学院
利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性
实验目的
1. 了解利用基因工程技术在大肠杆菌中表达外源蛋白
的原理；
2. 掌握SDS-PAGE的原理、实验操作过程及重要性。
实验原理
基因的基本结构
基 因
转录区
启动子
ATG
终止子
TGA
ORF：Opening Reading Frame
RNA起始点
核糖体结合位点
实验原理
影响基因表达的因素：
启动子： 控制基因表达的第一步，是高表达的关键；
结构基因：密码子稀有性；
表达载体的拷贝数：商业化，pET系列、pGEX系列等。
实验原理
目的基因：
受噬菌体T7强转录、
翻译及终止信号控制；
Lac操纵子；
T7 RNA聚合酶启动；
IPTG诱导；
有His-tagg标签；
大肠杆菌BL21
切
接
增
转
筛
表达
实验材料
1. 菌株：pET28a-svixyn/BL21(DE3)
2. 培养基及试剂
(1). 培养基：
LB液体培养基
(2). 电泳溶液
A. 凝胶贮存液：
丙烯酰胺 29g；甲叉丙烯酰胺 1g，加水至100ml，置于棕色瓶中， 4℃存放。
B. 8×浓缩胶缓冲液：1mol/L Tris-HCl,, 4℃存放。
C. 4×分离胶缓冲液：
Tis-HCl,, 4℃存放。
D. Tris-甘氨酸电泳缓冲液：
Tris , 甘氨酸 ，SDS ，pH ，4℃存放。
E. 上样缓冲液：
50 mmol/L Tris-HCl(pH ), 100 mmol/L 巯基乙醇， 2%(m/v) SDS,
% 溴酚蓝，10% (v/v)甘油。
F. 10% SDS
G. 10% 过硫酸铵
H. TEMED(N,N,N´,N´-四甲基乙二胺)
3. 仪器设备：
垂直板电泳槽，电泳仪、超声破碎仪、移液器、摇床等
实验步骤
1. 菌种的活化及酶的诱导表达
菌种活化：挑 pET28a-svixyn/BL21(DE3)单菌落于、
5ml LB+Km液体培养基37℃培养18h。
酶的诱导表达：1%的接种量转接于20mlLB+Km液体培养基于37℃培养至OD600=-，，于30℃摇床振荡培养2-6h，以 空载体为对照。
2. 融合蛋白的可溶性分析：
(1). 12000rpm 离心收集菌体，溶于无菌水中；
(2). 超声破碎菌体：功率 200W，4sec，破碎90次，至菌液澄清；
(3). 12000rpm离心5min收集上清；
(4). 将沉淀悬于无菌水中；
(5). 分别取上清、沉淀做样品处理及SDS-PAGE分析。
3. 样品处理：向样品中加入等体积的SDS凝胶上样缓冲液，煮沸5min，冷却后上样或-20℃保存。
4. 电泳
制胶
点样
电泳
染(脱)色
表 分离胶与浓缩胶的配制
12%分离胶
5%浓缩胶
水
40%凝胶储液(ml)
分离胶缓冲液(ml)
浓缩胶缓冲液(ml)
10% SDS (ml)
10% 过硫酸铵 (ml)
TEMED (ml)
总体积 (ml)
—
15
—
5
注意：灌胶前加过硫酸铵和TEMED
制胶：事先装好电泳板，配分离胶后立即用注射器灌胶，加少量水覆盖胶平面，聚合30min；倒掉或用吸水纸吸干水后，灌浓缩胶，插上梳子，聚合30min。
点样：小心将梳子拔掉；加入电泳缓冲液没过高低玻璃板中的低板，加样20-40μl。注：一定要记住点样顺序
电泳：稳压，浓缩胶电压 60V，电流约为10-15mA；分离胶电压150V，电流约25-30mA，电泳3-4小时，至指示剂溴酚蓝到达底部。
染(脱)色：考马斯亮蓝R-250染色约1h，后沸水脱色约15min，知道蓝色退去。
实验结果