文档介绍：第一部分
一、基本步骤：
1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；
2、引物、探针的设计；
3、引物探针的合成；
4、反响体系的配制；
5、反响条件的设定；
6、反响体系和条件的优化；
容易找到所有排序序列的较短片段的保守区。
2短片段探针(14-20bp)加上MGB后，Tm值将提高
10℃，更容易达到荧光探针Tm值的要
求。
2MGB探针的设计原则
2探针的5’端防止出现G，即便探针水解为单个碱基，与报告基团相相连的
G碱基仍可淬灭
基团的荧光信号。
2用primerexpress
软件评论Tm值，Tm值应为65-67℃。
2尽量缩短Taqman
MGB探针，但探针长度不少于
13bp。
2尽量防止出现重复的碱基，尤其是
G碱基，应防止出现4个或4个以上的G重复出现。
2原则上MGB探针只需有一个碱基突变，
MGB探针就会检测到(MGB探针将不会与目的片
段杂交，不产生荧光信号)。因此，在进行SNP检测时，为了检测到突变子，即Taqman
MGB
不与目的片段杂交，不产生荧光信号，探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽
量放在中间1/3的地方。注意：为了知足上述要求的
4个条件，探针的突变位点可向
3’端
移动，但突变位点起码在离3’端2
个碱基的前方(即必须保证探针的后两个碱基是绝对的保
守)，以进行SNP检测。反过来，若要进行同类检测，找的是保守片段区，探针中不应有突变位点。若探针即便是只有13个bp,探针仍不完全保守。有几个突变，突变位点也应凑近探针的5’端，这样，即便是突变，探针也可与目的片段杂交，产生荧光信号。另一种方法是设计简并探针，也可达到即便是突变，仍可检测到突变。
：
多重实时PCR的多种含意有两种：一为选择保守的探针和引物
，利用不同的染料标记探针，
在检测时可根据荧光的颜色来判断不同的产物
。另一种为选择保守的引物，扩增不同长度的
目的片段，反响中加入SYBRN染料，最后根据不同目的片段的
Tm值来判断不同的物品。
多重实时PCR的荧光探针应为同一种类：好像时为Taqman
探针、或同时为
MGB探针、
或同时为Beacon探针。
在多重PCR中，多重PCR的各个引物之间相互扰乱和各个探针之间相互扰乱剖析
:
设计好各对引物和探针后，从头在用DNAstar
软件中的Primerselect软件，翻开保守在同
一文件中的多重PCR的引物文件，然后两两分别选中所设计的多重引物或两两分别选中所
设计的多重探针后，在“report”菜单下“primer
pairdimers”,剖析上下游引物的
dimers。弹出
的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer，并对此对引物用dG值进行评论(往常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。
3、影响PCR及荧光PCR的其他因素
引物的设计和选择切合荧光
PCR的探针并进行设计关于实时荧光PCR
尤其重要。能够说，
不合理的设计意味着绝对的失败。可是，好的设计并不等于好的实验结果，影响
PCR和荧
光PCR的因素特别多，下面择其重要进行介绍。
引物的一个重要参数是熔解温度（
Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链
DNA
分子时的温度。Tm关于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，
以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性联合。合理的退火温度
从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的
Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。确定引物
Tm最可信的方法是近邻剖析法。大多半计算机程序使用近
邻剖析法——从序列一级构造和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。所有
oligo
软件会
自动计算引物的
Tm值。在设置退火温度时能够如下进行：以低于估算的
Tm5℃作为开端
的退火温度，以
2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特
异性产物的形成。为获得最正确结果，两个引物应拥有近似的
Tm值。引物对的Tm差别如果
超过5℃，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出显然的错误开端。如果两个引物
Tm不同，将退火温度设定为比最低的
Tm低5℃。或许为了提高特异性，能够在根据较高
Tm设计的退火温度先进行
5
个循环，然后再根据较低