文档介绍：第一部分一、基本步骤: 1 、目的基因( DNA 和 mRNA )的查找和比对; 2 、引物、探针的设计; 3 、引物探针的合成; 4 、反应体系的配制; 5 、反应条件的设定; 6 、反应体系和条件的优化; 7 、荧光曲线和数据分析; 8 、标准品的制备; 二、技术关键: 1、目的基因( DNA 和 mRNA )的查找和比对; / 网点的 genbank 中下载所需要的序列。下载的方式有两种: 一为打开某个序列后,直接点击“ save ”,保存格式为“.txt ”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后,再打开 DNAstar 软件中的 Editseq 软件,点击“ file ”菜单中的“ import ”, 打开后点击“ save ”, 保存为“.seq ”文件。另一种直接用 DNAsta r 软件中的 Editseq 软件,点击“ file ”菜单中的“ open entrez sequence ”,导入后保存为“.seq ”文件, 保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用 DNAstar 软件中的 Seqman 软件,点击“ sequence ”菜单中的“ add ”,选择要比较的“.seq ”的所有文件,点击“ add ”或“ add all”,然后点击“ Done ”导入要比较的序列,再点击“ assemble ”进行比较。横线的上列为一致性序列,所有红色的碱基是不同的序列,一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定比较序列的开始与结尾。有时因为参数设置的原因, 可能分为几组(contig) ,若想全部放在一组中进行比较,就调整“ project ”菜单下的“ parameter ”,在“ assembling ”内的“ minimum math percentage ”默认设置为 80 ,可调低即可。再选择几个组,点击“ contig ”菜单下的“ reassemble contig ”即可。选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“ contig ”内的前提下, 尽量提高“ minimum math percentage ”的值。有时因此个别序列原因, 会出现重复序列, 碱基的缺失或插入, 要对“ contig ”的序列的排列进行修改, 确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后, 点击“ save ”保存即可。分析时,主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色,对于弥散性的红色是不可用的。 2、引物和探针设计引物设计细心地进行引物设计是 PCR 中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点: 2 序列选取应在基因的保守区段; 2 扩增片段长度根据技术的不同有所分别: sybr green I 技术对片段长度没有特殊要求; Taqman 探针技术要求片段长度在 50bp - 150bp ; 2 避免引物自身或与引物之间形成 4 个或 4 个以上连续配对; 2 避免引物自身形成环状发卡结构; 2 典型的引物 18 到 24 个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大