文档介绍：PCR技术(十二):PCR-SSCP的发展现状
随着分子生物学技术的发展,, PCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage,RNAase)、限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP),局限性较大,或要求实验条件高,-SSCP(下文称SSCP)作为检测基因突变的方法,经不断地改进和完善,更为简便、快速、灵敏,不但用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入,而且还被用于DNA定量分析,监测PCR诊断实验中的交叉污染情况,,近几年被大量地应用.
一、SSCP的原理及特点
日本Orita等研究发现,单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象,这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的,当有一个碱基发生改变时,会或多或少地影响其空间构象,使构象发生改变,,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),(Single-Strand Conformation Polymorphism,SSCP),作者又将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变,从而建立了PCR-SSCP技术,:①PCR扩增靶DNA;②将特异的PCR扩增产物变性,而后快速复性,使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后通过放射性自显影、,就可以判定该链构象发生改变,、快速、灵敏,不需要特殊的仪器,,只能作为一种突变检测方法,要最后确定突变的位置和类型,还需进一步测序;电泳条件要求较严格;另外,由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的,这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时,再加上其他条件的影响,,,经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变,90%可被SSCP发现,,SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离,.
二、SSCP的不断改进
SSCP技术自创立以来,经历了自身发展和完善的过程,刚建立时是将同位素掺入PCR 扩增物中,,随着DNA