文档介绍：PCR技术(十四):反向PCR
描述一种大聚合酶链反应(PCR)应用的方法,使在已知序列的核心区边侧的未知 DNA成几何级数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA,以产生适合于PCR扩增大小的片段,然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR的引物同源于环上核心区的末端序列,但其方向性,使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列,还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。
引言
通常测定一个与已知序列相邻的DNA序列是必要的,例如位于编码DNA的上游和下游两侧的区域,转位因子的插入位点以及克隆于Lambda、科期粒或酵母人工染色体载体上的DNA片段末段的未知序列的探针等。这种末端特异探针在Southern Blot或染色体步查(Chromosome walking)所需的噬菌斑杂交或克隆杂交中都十分有用。
要得到边侧序列的探针一般需要进行一系列费时、费力的工作,首先用内切酶裂解和用已知边侧序列的探针Southern杂交以确定大小适合于克隆的末端片段;这些片段还要经过凝胶分离、克隆,得到的物质再与已知边侧区域杂交以确定合适的克隆子。要测定未吞边侧区序列时,通常需要从克隆中进行各种片段的亚克隆。
为避免这些步骤,我们采用扩展的PCR方法,使相邻边侧区域得以扩增。典型的PCR扩增使用与互补链杂交的寡聚核苷酸引物。引物是定向的,使延伸向内跨过两个引物之间的区域。一个引物的DNA合成产物作为另一个引物的模板,进行DNA变性、引物退火,DNA聚合酶管伸反应的多次重复性循环,可使引物规定区域的拷贝数成指数增加。但用传统PCR方法得不到紧邻引物外侧的DNA序列,因为寡聚核苷酸所引导的既有目的DNA又有引物外侧区的DNA合成在拷贝过程中只呈线性增长,这种线性增长是因为,对于每种引物来讲,其不能引导DNA反向合成(3'-5').
几乎是同时,有三个实验室分别设计出一种方法,使PCR可以扩增边侧区域。该方法(反向PCR)的基本点是用适当内切酶裂解核心区外分子,使这些酶切片段自身连接形成环状分子,从而将边侧区域转化为内部区域。用与核心区末端同源的引物,但其 3'端趄向未知区域,可以进步用PCR扩增环中的未知区域,该方法如图1所示。
反向PCR程序
Ochman等[5],Triglia等[6]和Silver、Keerikatte[7]的文章中详细地描述了反向 PCR的不同应用,下面是Ochman[1]等描述的方法概要。
用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。反向PCR所扩增的片段的大小由 PCR扩增片段的大小决定,目前,PCR扩增的实际上限为3-4kb。在许多情况下,首先需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端片段。能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游或上游区,而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增,并带有由内切酶和环化类型决定的接点(例如,互补突头连接与钝头连接)。对于扩增左翼或右翼序列,初试时最好靠近识别上个碱基位位的酶,并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向 PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针,建议事先在载体中引入合适的酶切位点。
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