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遗传学报, :
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巨大芽孢杆菌淀粉酶基因的克隆及其在
枯草杆菌中的表达
吕向阳蒋如璋王桂芬
南开大学生物系生物工程研究室,天律
以噬菌体为载体,采用鸟枪法由占. 基因组克隆得到了十淀粉酶基因,井
已被亚克隆到直. 。,,其表达水平较高倍。克隆株
产生的淀粉酶对直链淀粉的早期水解产物主要为麦芽三话和麦芽塘,随着水解时间的延长,又
将它们转变为葡萄糖。同时能以麦芽三辖为底物水解为麦芽糖和葡萄糖。受体菌的平行提取
物无上述水解活性。因而该酶被确定为糖化型一淀粉酶一凝胶电冰法确定酶分子量为
道尔顿。
关键词分子克隆,糖化型一淀粉酶,巨大芽孢杆菌,枯草杆菌
芽孢杆菌属许多物种能产生多种胞外酶。一淀粉酶...是其
中重要的胞外酶之一。多年来,人们对其表达的遗传调节和工业开发已做过广泛地研究。
.,曲加、. . 、.、.
和.“”等菌种的淀粉酶基因已被克陛,其中一些菌种的
淀粉酶基因的碱基顺序已经确定。通过比较它们的蛋白质一级结构,发现细菌液化型一
淀粉酶之间有很高的同源性%以上,而液化型与糖化型一淀粉酶之间只有局部同源
性。
为了比较研究不同芽孢杆菌产生的一淀粉酶的结构与功能以及结构与理化性质之
间的关系,研究原核生物胞外蛋白的分泌机制,我们在液化型一淀粉酶基因克隆的基础
上,由. 克隆得到了男一淀粉酶基因,
基因供体菌株高倍。该基因编码的一淀粉酶不仅能将可溶性淀粉水解为麦芽三糖
和麦芽糖等,继而还能将麦芽三糖和麦芽糖水解为葡萄糖,因而披确定为糖化型一淀粉
酶。
材料和方法
一菌株、噬菌体和质粒本研究中所用的丑.“、.“、
:、五“、..、. .
.
—、噬菌体“和质粒“均系本室保藏;质粒
车于年月日收到。
现在中国医学科学院抗菌素所; 南开大学生物系中心实验宣
瘤写词::氩苄青霉素; 羁毒素; 卡霉紊;:十二烷基硫鲑钠; :千碱基对.
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为本室构建。
二培养基培养基: 用于细菌和噬菌体的液体和固体培养的通用培养
基。在筛选淀粉酶阳性噬菌斑时采用培养基作为平板底层。和培养
基: 用于芽孢杆菌原生质体转化和细胞壁再生。培养基为/:蛋白胨,牛.
肉膏,酵母膏,.,用前加一/。用于噬菌体包装
蛋白质的制备。
三酶和试剂限制性核酸内切酶、一连接酶、聚合酶、’
酶、酶和蛋白酶,购自华美生物工程公司、医科院基础所或公司; 一淀粉酶和麦芽
糖,购自西德公司;麦芽三糖,购自公司;马铃薯淀粉,购自英国化学
公司; 一—和一—,购自北京福瑞诊断用品公司。其他试剂均为国产分
析纯。
四制备染色体按方法“制备,质粒按
法“并经密度梯度离心纯化。限制片段按琼脂糖凝胶电泳法制
备。
五噬菌体包装蛋白的制备按法略加修改。采用培养基,
,按强伯勤法私人通信加适当超声波
处理。
六的酶切和连接限制性内切酶的使用按厂家推荐方法。采用噬菌体
的限制片段为分子量标准。载体与供体片段按比例混
台,加一连接酶后置—℃保温过夜。
;芽孢杆菌原
生质体转化按等法进行;筛选培养基中抗菌素含量: /,/,
/。