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吕小锋司彗峰赵歌摘要:通过本实验研究得出以下结论:力竭运动后L组RBCMNa+-K+ATP酶活性增加,提示适宜负荷的运动训练不但可提高安静时酶活性,且可增强其活性的储备力。H组酶活性受其膜组成及物理特性改变的影响而下降,反过来又影响膜特性及功能,提示大负荷训练造成的膜理化性质的改变是相互关联的。运动训练对Ca2+-ATP酶活性无明显影响,H组活性的下降与其RBCM上脂质组成及其膜流动性的变化有关。
关键词:不同负荷;运动训练;大鼠;红细胞膜
目前国内关于运动与红细胞膜特性的研究开展的较少,且主要局限于某一特定负荷下、运动某一时刻红细胞膜理化特性的改变上,很少涉及不同强度运动后的改变,关于运动训练对红细胞膜影响的研究则寥寥无几。国外的研究也大多只是从宏观上来观察运动与红细胞膜功能状态变化的关系,对于其可能的微观机理的探讨则很少,特别是关于不同负荷训练对于红细胞膜特性影响及训练后再进行定量负荷运动的影响的综合性研究还未见报道。本实验将对此问题作更深入的研究。
1材料与方法
,鼠龄2个月,体重180~200g,由西安交通大学实验动物中心提供。购后分笼饲养,自由饮食。光照时间6:30~19:00。
大鼠在实验室适应性喂养一周,按体重分层,随机分为三大组:正常对照组(C组,18只),小负荷游泳训练组(L组,20只),大负荷游泳训练组(H组,翅只)。其中对照组又随机分为安静组(CⅠ组,9只)和力竭组(CⅡ组,9只),大、小负荷游泳组又随机分为运动训练组(LⅠ组,10只;HⅠ组,11只)和训练后力竭组(LⅡ组,10只;HⅡ组,11只)。

,水温30±1℃,×。水深>,,实验过程中以小棍驱赶动物,从而保持一定的运动强度。每天都确保在同一时间即每日13:00―18:00进行训练。
,平均约2h,分别取其80%()和50%(1h)的值预设为大、小负荷训练组第一周内所达到的负荷量(,),以此负荷进行训练,并于第一次负荷前及运动后即刻测定各组的血乳酸值,运动前安静值分别为L:±;H:±,运动后即刻L:±;H::,,经检验各组运动前后及两组运动后血乳酸均有显著性差异,即可认定为不同负荷训练。
,适应性喂养一周,期间L及H组大鼠进行适应性游泳训练,每天约15min左右,正式训练开始后的负荷安排如下:CⅠ组常规喂养,不进行任何运动至实验结束;CⅡ组常规喂养,只在处死前一天进行适应性游泳训练20min;L组每周训练6d,每天训练一次,第一天下水游泳时间为30min,此后以5min的速度逐日递增,第一周末时游1h,,第三周末时游2h,第四周维持这一运动量至训练结束;H组每周训练6d,每天训练一次,第一次下水游泳时间为1h,此后以5min的速度逐日递增,,第二周末时游2h,由第三周起开始尾部负1%体重,每天游2h,第四周起负重增为3%体重,每天游2h。

,CⅠ、LⅠ及HⅠ组大鼠用20%乌拉坦()腹腔麻醉后仰位固定于自制的动物手术操作台上,开腹,分离腹主动脉并由腹主动脉分为左、右髂动脉处进针,注入肝素抗凝,待抗凝完全后,由腹主动脉抽取血液约6mL,置试管内待用。CⅡ、LⅡ及HⅡ组大鼠则在训练结束48h后负6%体重进行力竭游泳,力竭后即刻开腹取材(整个操作在室温下连续进行)。力竭标准为:大鼠协调运动消失,经10s后仍不能返回水面。
,4℃下离心5min,除去血浆和灰白色的白细胞层,加入预冷的生理盐水将沉淀的红细胞悬浮,洗涤3次,离心条件同上。沉淀的红细胞按1/10(v/v)加人预冷的破膜液(,,,―),均匀搅拌2min,待完全溶血后,以12000r/min4℃离心10min,将沉淀重复依上法再洗涤3次,即可得到乳白色的红细胞膜样品,-20℃冰箱冻存。
)红细胞膜Na+―K+ATP酶活性
2)红细胞膜Ca2+ATP酶活性
1)-2)用试剂盒(均购于南京建成生物制品公司)测定,操作依照说明书进行。
,以平均数加减标准差(X±SD)来表示,并以P<,各组之间数据比较采用LSD法检验。
2结果
+-K+ATP酶及Ca2+-ATP酶活性变化由表1的结果可见,C组、L组力竭后Na+-K+ATP酶活性升高,而H组力竭后活性却下降。进一步进行安静组之间的比较发现,小负荷运动训练后膜Na+-K+ATP酶活性升高,大负荷训练的结果正好相反。
从表1的结果看,力竭后即刻各组RBCM上Ca2+-ATP酶活性都有下降。由安静组之间的比较可见,L组比C组活性提高,但没有显著性差异,H组与C组比较活性显著下降。
(SalivaryacidSA)广泛存在于动物组织及微生物中,是细胞膜糖蛋白和糖脂的主要成分,位于细胞膜糖蛋白及糖脂的末端,参与细胞表面多种生理功能。在细胞老化过程中,SA可从膜表面脱落,从而使膜上SA含量下降。因此,膜上SA含量可作为判断细胞老化程度的指标之一。由表2的结果可见,力竭运动后各组红细
胞膜上SA含量均显著下降,提示力竭运动时机体内环境的变化可加速红细胞的老化,使大量的SA由红细胞膜上脱落。L组、H组与C组间比较,虽然分别有微升、微降的趋势,但均未形成显著性差异,与前人的研究成果不太一致,是由于SA对运动训练不敏感还是训练时间太短不足以使其发生显著性改变,都有待于进一步的研究证明。
3讨论
+-K+ATP酶、Ca+-ATP酶活性变化的影响(图1)Na+-K+ATP酶是广泛存在与真核细胞膜上的内在蛋白。RBCMNa+-K+ATP酶的基本功能是将细胞内的Na+转移到细胞外,将细胞外的K+运送入细胞内,维持细胞内外的渗透压平衡和跨膜电化学梯度。如果红细胞内失Na+而K+量增加,水分亦随Na+进入细胞内,这样可使红细胞体积增大而变成球形,红细胞的变形性下降。这可能是一些运动性贫血和力竭运动后红细胞溶血增强的原因之一。RBCM上Ca2+-ATP酶不但对维持膜脂的不对称分布起主要作用,还可维持细胞内Ca2+的浓度。细胞内[Ca2+]升高可影响膜蛋白相互作用,降低RBCM粘弹性,膜变僵硬,并可导致RBCM脂质与细胞膜骨架蛋白的分离,使膜稳定性和流动性降低,红细胞变形能力下降。
本研究发现(图1),除H组呈下降趋势外,其余两组Na+-K+ATP酶活性在力竭运动后均有显著上升。各安静组之间的比较显示L组酶活性升高而H组与C组比较呈下降趋势,认为适当的运动训练不但可提高安静时酶活性且可增强其活性的储备力,从而有较高的对抗激烈运动的能力。过大负荷的结果正好相反。对Ca2+-ATP酶活性的研究发现,力竭后各组活性均显著下降,安静时,L组虽较C组活性有提高,但无显著差异,而H组下降显著,说明运动训练对Ca2+-ATP酶活性的影响不大,但过大负荷训练后仍会造成酶活性的损伤。
细胞膜是最易受到自由基攻击的部位之一,因此运动过程中随自由基反应的增强,酶活性应呈下降趋势。Ciraci等报道Na+-K+ATP酶的活性与膜脂流动性特别是膜内层的流动性呈正相关。然而一定程度的运动却似乎可以提高tlBCMNa+-K+ATP酶的活性。孙湄、高庆生曾对机能良好的运动员进行测试,结果表明RBCMNa+-K+,说明RBCM上Na+-K+ATP酶活性在运动中增强是正常机体对运动的生理性反应,反映机体能量和物质代谢水平的提高。除此之外,酶活性的改变还与运动时间有关。本实验的运动方式为负重力竭游泳,因此力竭时间较短,ATP仍未完全消耗,因此力竭运动后Na+-K+ATP酶活性表现为升高。黄美光、刘化林的研究结果证实,急性运动使正常人RBCM上Na+-K+ATP酶活性升高,而使肥胖者酶活性下降,反映出两者在膜分子水平上对急性运动反应不同。这种情况可能类似于L、H组的变化。说明经过不同负荷训练后两组酶活性储备不同,对急性运动的反应不同。还有的国内学者观察到与Na+-K+ATP酶在定位和功能上相关的区带3蛋白,运动后出现一定的凝集,与酶活性的提高呈正相关。然而运动时若能量供应不足以满足Na+-K+ATP酶工作的需求,同样会使酶的工作效率下降。因此对酶活性的变化应综合进行分析。
运动后Ca2+―ATP酶活性变化机制的研究更为少见。从本实验结果分析Ca2+-ATP酶活性主要与膜上脂质成分及膜流动性的变化相关(相关数据见文章不同负荷运动训练对大鼠红细胞膜的影响Ⅰ、Ⅱ)。孙湄等报道青少年进行次极限强度运动后RBCMCa2+-ATP酶活性下降。另外运动时ATP供应不足可能是酶活性下降的一个原因。运动训练后L组Ca2+-ATP酶活性并未出现显著上升,可能是此酶对运动时的低氧刺激不敏感或是训练时间太短,不足以使之产生显著性变化。此方面的机理还有待于进一步的深入探讨。
(图2)红细胞膜上除了蛋白质和脂类以外还含有少量糖,膜中的糖常以寡糖链形式与蛋白质和脂结合生成糖蛋白和糖脂。唾液酸即是细胞膜糖蛋白和糖脂的主要成分,广泛存在于动物组织和微生物中,位于细胞膜糖蛋白及糖脂的末端,参与细胞表面多种生理功能。唾液酸常出现在糖蛋白或糖脂末端,能够对抗许多酶的水解,对细胞膜起保护和识别作用。RBCM在唾液酸酶的作用下失去糖基末端唾液酸后,红细胞即被肝细胞表面特异受体-糖结合蛋白所识别,经胞吞作用(endocytosis)进入肝细胞内而被溶酶体清除。此过程参与红细胞的衰老与清除。因此有学者认为测定红细胞表面的SA含量可作为评价红细胞衰老程度的指标之一。
本实验(图2)中观察到力竭运动后各组RBCM表面的SA含量均显著下降,各安静组之间未见显著差异,推测运动过程中的氧化应激会造成RBCM上SA的脱落增加,使之更易为肝细胞识别而清除。间接说明剧烈运动会加快红细胞的老化。运动训练对SA的影响甚微。有关运动与EBCMSA含量关系的文章只有一篇,其结果与本文相似,即一次急性运动后RB-CMSA含量下降。
4结论
力竭运动后L组RBCMNa+-K+AIP酶活性增加,提示适宜负荷的运动训练不但可提高安静时酶活性,且可增强其活性的储备力。H组酶活性受其膜组成及物理特性改变的影响而下降,反过来又影响膜特性及功能,提示大负荷训练造成的膜理化性质的改变是相互关联的。运动训练对Ca2+-ATP酶活性无明显影响,H组活性的下降与其RBCM上脂质组成及其膜流动性的变化有关。
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