文档介绍：实时定量 PCR在基因表达研究中的应用
——完整优化的实验流程设计
Roche Applied Science, Oct. 2011
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PCR定量原理
实时荧光PCR
−实时荧光信号检测
−数学分析
荧光定量PCR 常规PCR
实验目的起始模板量扩增后的产物总量
检测时间点扩增时平台期
实时定量 PCR的定量分析:定量原理

Sample A
Sample B
Ct / Cp Cq值与模板初始浓度存在负相关的数学关系
目标基因拷贝数多=>反应很早开始进入指数增长=>Cq值小
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基因表达分析——相对定量
转录翻译
•目的:
–在复杂的基因表达背景中定量检测 mRNA 的微量变化
–获得稳定的,可重复的实验数据

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qPCR行业质量标准
由业内专家制定
大纲
•实时定量PCR荧光信号检测方法
- 探针法
- 染料法
•简化方法学验证——使用预混的反应液
•准确的数学计算方法
• MIQE:完整的实验流程设计

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检测方法- 荧光染料
• SYBR Green I
–不依赖于序列
–不饱和 dsDNA 结合染料
–激发: 488nm; 发射: 533nm
–在扩增循环(延伸)和熔解曲线过程中检测
退火延伸延伸结束时
Annealing Elongation End of Elongation
检测方法- 荧光染料
熔解曲线分析
65°C—— 95°C 温度缓慢上升
检测方法- 探针
•水解探针(Hydrolysis Probes): TaqMan Probes
–荧光报告基团与淬灭基团
–聚合酶的 5’核酸酶活性将荧光素从探针上释放
–在扩增循环(延伸)中检测信号
Example:
淬灭剂
FAM
Exc. 465nm
Emi. 510nm
变性退火
检测
延伸延伸结束
实时定量PCR方法设计要点
•实时定量PCR荧光信号检测方法
- 探针法
方法设计有效? OR
- 染料法

•简化方法学验证——使用预混的反应液
•准确的数学计算方法
• MIQE:完整的实验流程设计

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