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)实验方法
免疫荧光技术是在免疫学、
生物化学和显微镜技术的基础上成立起来的一项技术。
它是
依据抗原抗体反响的原理,
先将已知的抗原或抗体标志上荧光基团,
再用这种荧光抗体(或
抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)
。利用荧光显微镜能够看见荧光所
在的细胞或组织,进而确立抗原或抗体的性质和定位,
以及利用定量技术(比方流式细胞仪)
测定含量。
免疫荧光实验的主要步骤包含细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、关闭、抗体孵
育及荧光检测等。细胞片制备(平常的说法是细胞爬片)
是免疫荧光实验的第一步,细胞片
的质量对实验的成败至关重要,
原由很简单,假如发生细胞掉片,
全部都无从谈起。这一步
重点的是玻片(SlidesorCoverslips)的办理以及细胞的活力,有人依据成功经验总结出
很多有利的细节或小诀窍,
特别值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是依据所研究抗原的性
质选择适合的固定方法,
适合的固定剂和固定程序关于获取好的实验结果是特别重要的。
免
疫荧光中的关闭和抗体孵育与其余方法(如
ELISA或WesternBlot
)中的相同步骤是近似
的,最重要的差别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体,
所以一定牢记避光操作,
别的抗体
浓度的选择可能更为重点。
最后需要注意的是,
标志好荧光的细胞片应尽早察看,
或许用封
片剂封片后在4℃或-20℃避光保留,免得因标志蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
因为操作步骤比许多,同时在剖析结果时没法像
WB那样能够依据分子量的大小划分非
特异性辨别,所以要获取一个完满的免疫荧光实验结果,
除了需要高质量的抗体,
以及对实
验条件进行频频优化外,
还一定建立谨慎的实验比较。
总之,免疫荧光实验从细胞样品办理、
固定、关闭、抗体孵育到最后的封片及察看摄影,
每步都特别重点,需要严格控制实验流程
中每个步骤的质量,才能最后达到你的实验目的。
基本实验步骤:
(1)细胞准备。对单层生长细胞,
在传代培育时,将细胞接种到早先搁置有办理过的
盖玻片的培育皿中,待细胞凑近长成单层后拿出盖玻片,
PBS洗两次;对悬浮生长细胞,取
对数生长细胞,用PBS离心清洗(1000rpm,5min)2次,用细胞离心甩片体制备细胞片或直
接制备细胞涂片。
2)固定。依据需要选择适合的固定剂固定细胞。固定完成后的细胞可置于含叠氮纳
PBS中4℃保留3个月。PBS清洗3×5min.
3)通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前,
对细胞进行通透办理,以保证抗体能够抵达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-×5min.
(4)关闭。使用关闭液对细胞进行关闭,时间一般为30min.
(5)一抗联合。室温孵育1h或许4℃留宿。PBST漂洗3次,每次冲刷5min.
(6)二抗联合。间接免疫荧光需要使用二抗。,每次
冲刷5min后,再用蒸馏水漂洗一次。
(7)封片及检测。滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查。
(一)细胞准备
用于免疫荧光实验的细胞能够是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞,也能够是经过离心后
涂片的悬浮细胞或许是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁优秀的细胞一般在培育
时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可,尽量防止使用贴壁性能不好的细胞进行免
疫荧光实验,免得后续的漂洗操作惹起细胞零落。少量实验需要使用这种细胞或许悬浮细胞
进行免疫荧光察看,建议使用细胞离心甩片体制备细胞片或直接制备细胞涂片。
(二)固定和通透
除研究细胞表面抗原或不稳固抗原可不固定外,一般均应固定。固定的目的有三:
①防备细胞从玻片上零落;
②除掉防碍抗原-抗体联合的类脂;
③使标本易于保留。
标本的固定原则是:
①不可以损害细胞内的抗原;
②不可以凝聚蛋白质;
③应保持细胞和亚细胞构造;
④固定后应保持通透性,以保证抗体自由进入全部细胞与亚细胞组分与抗原联合。
常用的固定剂有多种,应依据所研究抗原的性质和所使用的抗体特征选择适合的固定
剂。往常固定方法能够分为两类:有机溶剂和交联剂。有机溶剂如甲醇和***等可去除类脂
并使细胞脱水,同时将细胞构造蛋白积淀。交联剂如多聚甲醛往常经过自由氨基酸基团形成
分子间桥连,进而产生一种抗原互相连结的网络构造。交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的
构造,但因为交联阻挡抗体联合,可能会降低一些细胞组分的抗原性,所以需要增添一个通
透步骤以使抗体能够进入标本。两种固定方法都可能使蛋白抗原变性,所以使用变性蛋白作
为抗原生产的抗体在免疫荧光中可能更为有效。
最常用的固定剂有多聚甲醛和甲醇,少量状况也使用乙醇,***及戊二醛等进行固定。
往常,细胞构造抗原、病毒及一些酶类抗原使用***、乙醇及高浓度的甲醛固定可获取较好
的结果,而细胞膜有关组分抗原一般以多聚甲醛固定。细胞器和细胞颗粒内的抗原一般也用
多聚甲醛固定,并需要进行通透以使抗体能达到抗原表位。
通透步骤只在检测细胞内抗原表位的时候才需要,因为抗体需要进入细胞内部去检测蛋
白。可是,假如待检测的是跨膜蛋白,且其抗原表位处于胞质内地区,则相同需要对细胞进
行通透。相反,假如所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段,则不需要进行通透。***自己
拥有通透作用,所以用***作为固定剂时是不需要通透的。甲醇相同拥有通透作用,但有些
场归其实不适合用甲醇,因为一些表位对甲醇特别敏感。常用的通透剂是去垢剂,如
Triton,NP-40,以及Tween20,Saponin,Digitonin和Leucoperm等。Triton和NP-40
属于烈性去垢剂,可部分溶解细胞核膜,所以特别适合核抗原检测。但应当注意的是,假如
在高浓度下使用或许作用时间过长,它们将损坏蛋白,进而影响实验结果。TritonX-100
是最常用的通透剂,可是它将损坏细胞膜,所以不合用于细胞膜有关抗原。后边一组去垢剂
要平和得多,它们能够在细胞质膜上形成足够大的孔隙以同意抗体经过,可是不会溶解细胞
质膜。适于胞质抗原或许质膜上凑近胞质一面的抗原,也适于可溶性的核抗原。
一般的操作程序是先固定后通透,但针对有些水不溶性的目的抗原的检测宜先通透再固
定,这样做的原由主假如能够经过通透去除很多水溶性的蛋白,进而大大减少了免疫荧光的
背景和非特异性信号。固定后以冷PBS液漂洗,最后以蒸馏水冲刷,防备自觉性荧光。
(三)关闭
关闭的目的是为了减少抗体的非特异性联合,最常用的关闭剂为1%BSA,,
其余可选择的关闭剂还有1%gelatin,1%bovine或与二抗种属相同的血清(3-10%)等。
(四)抗体孵育
直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧光法中的二抗都是荧光抗体,所以在这些抗体孵
育的时候一定注意避光。别的,为保证联合质量和防备干燥,抗体孵育应尽量在湿盒中进行。
(五)封片及荧光察看
标志好荧光的细胞片原则上能够直接进行察看,特别是有时封片不妥反而使得半途而废。但在绝大部分状况下,为了保留结果,以便进一步察看、照像、统计剖析等,需作封片
办理。惯例的方法是采纳甘油或中性树脂封片,为了增强封片的成效,常常需要在封片刻增添特别的抗荧光淬灭剂。
(六)标本保留
因为荧光色素和蛋白质分子的稳固性都是相对的,所以跟着保留时间的延伸,在各样条
件影响下,标志蛋白可能变性解离,失掉其应有的亮度和特异性。所以给标本的保留带来一
定的困难,所以在标本进行荧光染色以后应立刻察看。因为性能优秀的抗荧光淬灭剂的出现,
荧光标志的标本能够在低温(4℃或-20℃)下保留相当长的时间。在某些情况下,考虑到实
验的成本及实验条件,也能够采纳权宜的方法,比方固定标本片后低温保留,在需要时再进行荧光标志,即随用随染。
直接免疫荧光法测抗原
基根源理
将荧光素标志在相应的抗体上,直接与相应抗原反响。其长处是方法简易、特异性高,非特异性荧光染色少。弊端是敏感性偏低;并且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的迅速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水(PBS):,
荧光标志的抗体溶液:,
缓冲甘油:剖析纯无荧光的甘油9份+
搪瓷桶三只(,)
有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸润的纱布垫)
荧光显微镜
玻片架
滤纸H
37℃温箱等。
1份配制
实验步骤
1、滴加
,
的PBS于待检标本片上,
10min
后弃去,使标本保持必定湿
度。
2、滴加适合稀释的荧光标志的抗体溶液,使其完整覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保
温一准时间(参照:30min)。
3、拿出玻片,置玻片架上,,,
,每缸3-5min,时时振荡。
,
4、拿出玻片,用滤纸吸去剩余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆
盖。
5、立刻用荧光显微镜察看。察看标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示:
-)无荧光;(±)极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(++)荧光光亮;
+++--++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各样比较显示为(±)或(-),即可判断为阳性。
注意事项
1、对荧光标志的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有必定的浓度,一般稀释度不该超出
1:20,抗体浓度过低,会致使产生的荧光过弱,影响结果的察看。
2、染色的温度和时间需要依据各样不一样的标本及抗原而变化,染色时间能够从10min
到数小时,一般30min已足够。染色温度多采纳室温(25℃左右),高于37℃可增强染色
成效,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采纳0-2℃的低温,延伸染色时间。
低温染色留宿较37℃30min成效好的多。
3、为了保证荧光染色的正确性,初次试验时需设置下述比较,以清除某些非特异性荧光染色的扰乱。
1)标本自觉荧光比较:标本加1-,。
2)特异性比较(克制试验):标本加未标志的特异性抗体,再加荧光标志的特异性
抗体。
3)阳性比较:已知的阳性标本加荧光标志的特异性抗体。
假如标本自觉荧光比较和特异性比较呈无荧光或弱荧光,阳性比较和待检标本呈强荧
光,则为特异性阳性染色。
4、一般标本在高压***灯下照耀超出3min,就有荧光减弱现象,经荧光染色的标本最好
在当日察看,跟着时间的延伸,荧光强度会渐渐降落。
免疫荧光染色(间接法)
1、切片固定后用毛细滴管汲取经适合稀释的免疫血清滴加在其上,置于染色盒中保持
必定的湿度,37℃作用30min。,10min,用吸水吸去或
吹干余留的液体。
2、再滴加间接荧光抗体(如兔抗人-球蛋白荧光抗体等),同上步骤,染色30min,
37℃,缓冲盐水洗两次10min,搅拌,缓冲甘油封固,镜检。
比较染色:①抗体比较:用正常兔血清或人血清朝替免疫血清,再用上法进行染色,结
果应为阴性。②抗原比较:即类属抗原染色,亦应为阴性。③阳性比较。
间接法中上述方法称双层法(DoubleLayerMethod)。另一种称夹心法,即用未标志
的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体联合,再用该抗原之荧光抗体重叠联合其
上,而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在,方法步骤以下:
①切片或涂片固定后,置于染色湿盒内。
②滴加未标志的特异性抗原作用切片于37℃,30min。
③缓冲盐水洗2次,每次5min,吹干。
④滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃,30min。
⑤如③水洗。
⑥缓冲甘油封固,镜检。
易生物实验技术频道
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细胞内抗原的检测-间接免疫荧光法
细胞内抗原的检测过程与细胞表面抗原检测过程基本一致,不过在与一抗孵育前,需要早先对细胞用非离子去污剂进行透化办理。
【操作方法】
(1)取已固定好的细胞爬片或甩片或经过预办理的组织切片(白腊或冰冻切片);
(2)%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的细胞2min(室温),有些标本可能需要长达15min,时间视抗原而定;
3)余下步骤接上述“细胞表面抗原的检测-间接免疫荧光法”步骤(2);【注意事项】
1)在使用前,一抗二抗均应测试其适合的稀释度。
2)多聚甲醛的固定是不稳固的,标本经多聚甲醛固定后,应再用去污剂办理,假如
标本在水溶液中浸泡的时间过长,则会使交联构造解体。所以,应防止固定后的标本在水溶液中浸泡的时间过长。
3)信号轻微的解决方法:
①提升一抗和二抗的浓度以增强敏感性,这一定测试各样浓度抗体的滴度;
②延伸一抗和二抗的孵育时间。因为细胞染色时抗原吸附在固相载体上,抗原抗体联合
时间较在溶液中长。孵育时间可因实验设计作适合调整,但少于20min抗体和抗原几乎不可以
有效联合。在以上两点中,应探索出一个最正确条件以产生有效信号且保持优秀的背景。这就
需要频频试验,因为每组抗体和抗原的状况会有所不一样;
③改变检测方法,用共聚焦显微镜察看,可提升敏感性。
(4)背景不好的解决方法
细胞样本进行荧光染色时,背景问题主要来自两个方面,即非特异性染色和特异性
交错反响。
①非特异性吸附:非特异性吸附背景问题的产生与抗原抗体的特异性联合没关。即
一抗或二抗与样品互相作用而发生吸附,而不是与抗原发生特异性联合。
将全部抗体溶液或含蛋白的检测试剂用100,000′g离心30min以去除蛋白聚合物。
滴定一抗和所用的检测试剂,以确立能够产生适合信号的最低浓度。
固定后,用饱和量其实不被检测试剂联合的非特异性抗体关闭样品,有效的关闭液
包含5%的与标志二抗根源相同的同种血清、3%的BSA和3%的脱脂奶粉。
用上述关闭液稀释抗体和检测试剂。
*固定后,在全部的缓冲液及清洗液中加入2%吐温-20。
缩短一抗或标志试剂的孵育时间。
充分清洗(延伸清洗时间,重复次数)。
改变检测方法。②特异性背景:造成特异性背景问题的原由有三种要素,即污染抗体所致假阳性、
交错反响和样品中含有能与Ig联合的蛋白质。
如用多克隆抗体,应滴定抗体(假阳性)。
如用多克隆抗体,亲和纯化特异性抗体(假阳性)。
如用多克隆抗体,用适合的***肝脏粉汲取以阻抑假阳性。
换用其余抗体(交错反响及假阳性)。
武汉伊艾博有限企业