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免疫荧光(Immunofluorescence,IF
)实验方法
免疫荧光技术是在免疫学、
生物化学和显微镜技术的基础上成立起来的一项技术。
它是
依照抗原抗体反应的原理,
先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团,
再用这类荧光抗体(或
抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)
。利用荧光显微镜能够看见荧光所
在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质和定位,
以及利用定量技术(比方流式细胞仪)
测定含量。
免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵
育及荧光检测等。细胞片制备(平时的说法是细胞爬片)
是免疫荧光实验的第一步,细胞片
的质量对实验的成败至关重要,
原因很简单,若是发生细胞掉片,
所有都无从谈起。这一步
要点的是玻片(SlidesorCoverslips)的办理以及细胞的活力,有人依照成功经验总结出
好多有益的细节或小窍门,
特别值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是依照所研究抗原的性
质选择合适的固定方法,
合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是特别重要的。
免
疫荧光中的封闭和抗体孵育与其他方法(如
ELISA或WesternBlot
)中的同样步骤是近似
的,最重要的差异在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体,
因此必定切记避光操作,
其他抗体
浓度的选择可能更加要点。
最后需要注意的是,
标记好荧光的细胞片应尽早观察,
也许用封
片剂封片后在4℃或-20℃避光保存,省得因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比很多,同时在解析结果时无法像
WB那样能够依照分子量的大小区分非
特异性鉴别,因此要获得一个圆满的免疫荧光实验结果,
除了需要高质量的抗体,
以及对实
验条件进行屡次优化外,
还必定成立慎重的实验比较。
总之,免疫荧光实验从细胞样品办理、
固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照,
每步都特别要点,需要严格控制实验流程
中每个步骤的质量,才能最后达到你的实验目的。
基本实验步骤:
(1)细胞准备。对单层生长细胞,
在传代培养时,将细胞接种到起初放置有办理过的
盖玻片的培养皿中,待细胞凑近长成单层后取出盖玻片,
PBS洗两次;对悬浮生长细胞,取
对数生长细胞,用PBS离心冲洗(1000rpm,5min)2次,用细胞离心甩片体系备细胞片或直
接制备细胞涂片。
2)固定。依照需要选择合适的固定剂固定细胞。固定达成后的细胞可置于含叠氮纳
PBS中4℃保存3个月。PBS冲洗3×5min.
3)通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前,
对细胞进行通透办理,以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-×5min.
(4)封闭。使用封闭液对细胞进行封闭,时间一般为30min.
(5)一抗结合。室温孵育1h也许4℃过夜。PBST漂洗3次,每次冲洗5min.
(6)二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。,每次
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冲洗5min后,再用蒸馏水漂洗一次。
(7)封片及检测。滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查。
(一)细胞准备
用于免疫荧光实验的细胞能够是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞,也能够是经过离心后
涂片的悬浮细胞也许是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁优异的细胞一般在培养
时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可,尽量防范使用贴壁性能不好的细胞进行免
疫荧光实验,省得后续的漂洗操作引起细胞零散。少许实验需要使用这类细胞也许悬浮细胞
进行免疫荧光观察,建议使用细胞离心甩片体系备细胞片或直接制备细胞涂片。
(二)固定和通透
除研究细胞表面抗原或不牢固抗原可不固定外,一般均应固定。固定的目的有三:
①防范细胞从玻片上零散;
②除去防碍抗原-抗体结合的类脂;
③使标本易于保存。
标本的固定原则是:
①不能够伤害细胞内的抗原;
②不能够凝集蛋白质;
③应保持细胞和亚细胞结构;
④固定后应保持通透性,以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。
常用的固定剂有多种,应依照所研究抗原的性质和所使用的抗体特点选择合适的固定
剂。平时固定方法能够分为两类:有机溶剂和交联剂。有机溶剂如甲醇和***等可去除类脂
并使细胞脱水,同时将细胞结构蛋白积淀。交联剂如多聚甲醛平时经过自由氨基酸基团形成
分子间桥连,从而产生一种抗原相互连接的网络结构。交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的
结构,但由于交联阻拦抗体结合,可能会降低一些细胞组分的抗原性,因此需要增加一个通
透步骤以使抗体能够进入标本。两种固定方法都可能使蛋白抗原变性,因此使用变性蛋白作
为抗原生产的抗体在免疫荧光中可能更加有效。
最常用的固定剂有多聚甲醛和甲醇,少许状况也使用乙醇,***及戊二醛等进行固定。
平时,细胞结构抗原、病毒及一些酶类抗原使用***、乙醇及高浓度的甲醛固定可获得较好
的结果,而细胞膜相关组分抗原一般以多聚甲醛固定。细胞器和细胞颗粒内的抗原一般也用
多聚甲醛固定,并需要进行通透以使抗体能达到抗原表位。
通透步骤只在检测细胞内抗原表位的时候才需要,由于抗体需要进入细胞内部去检测蛋
白。但是,若是待检测的是跨膜蛋白,且其抗原表位处于胞质内陆域,则同样需要对细胞进
行通透。相反,若是所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段,则不需要进行通透。***自己
拥有通透作用,因此用***作为固定剂时是不需要通透的。甲醇同样拥有通透作用,但有些
场归其实不适适用甲醇,由于一些表位对甲醇特别敏感。常用的通透剂是去垢剂,如
Triton,NP-40,以及Tween20,Saponin,Digitonin和Leucoperm等。Triton和NP-40
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属于烈性去垢剂,可部分溶解细胞核膜,因此特别合适核抗原检测。但应该注意的是,若是
在高浓度下使用也许作用时间过长,它们将破坏蛋白,从而影响实验结果。TritonX-100
是最常用的通透剂,但是它将破坏细胞膜,因此不适用于细胞膜相关抗原。后边一组去垢剂
要平易得多,它们能够在细胞质膜上形成足够大的孔隙以赞同抗体经过,但是不会溶解细胞
质膜。适于胞质抗原也许质膜上凑近胞质一面的抗原,也适于可溶性的核抗原。
一般的操作程序是先固定后通透,但针对有些水不溶性的目的抗原的检测宜先通透再固
定,这样做的原因主若是能够经过通透去除好多水溶性的蛋白,从而大大减少了免疫荧光的
背景和非特异性信号。固定后以冷PBS液漂洗,最后以蒸馏水冲洗,防范自觉性荧光。
(三)封闭
封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合,最常用的封闭剂为1%BSA,,
其他可选择的封闭剂还有1%gelatin,1%bovine或与二抗种属同样的血清(3-10%)等。
(四)抗体孵育
直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧光法中的二抗都是荧光抗体,因此在这些抗体孵
育的时候必定注意避光。其他,为保证结合质量和防范干燥,抗体孵育应尽量在湿盒中进行。
(五)封片及荧光观察
标记好荧光的细胞片原则上能够直接进行观察,特别是有时封片不当反而使得功亏一篑。但在绝大多数状况下,为了保存结果,以便进一步观察、照像、统计解析等,需作封片
办理。老例的方法是采用甘油或中性树脂封片,为了加强封片的收效,经常需要在封片晌增加特其他抗荧光淬灭剂。
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(六)标本保存
由于荧光色素和蛋白质分子的牢固性都是相对的,因此随着保存时间的延长,在各种条
件影响下,标记蛋白可能变性解离,失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一
定的困难,因此在标本进行荧光染色此后应马上观察。由于性能优异的抗荧光淬灭剂的出现,
荧光标记的标本能够在低温(4℃或-20℃)下保存相当长的时间。在某些状况下,考虑到实
验的成本及实验条件,也能够采用权宜的方法,比方固定标本片后低温保存,在需要时再进行荧光标记,即随用随染。
直接免疫荧光法测抗原
基本源理
将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简略、特异性高,非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
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试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水(PBS):,
荧光标记的抗体溶液:以,
缓冲甘油:解析纯无荧光的甘油9份碳酸盐缓冲液
搪瓷桶三只(内有,)
有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸润的纱布垫)
荧光显微镜
玻片架
滤纸H
37℃温箱等。
1份配制
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实验步骤
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1、滴加
,
的PBS于待检标本片上,
10min
后弃去,使标本保持必然湿
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度。
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2、滴加合适稀释的荧光标记的抗体溶液,使其完好覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保
温一准时间(参照:30min)。
3、取出玻片,置玻片架上,先用,,再按序次过
,每缸3-5min,不时振荡。
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,
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4、取出玻片,用滤纸吸去节余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆
盖。
5、马上用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示:
-)无荧光;(±)极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(++)荧光光明;
+++--++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种比较显示为(±)或(-),即可判断为阳性。
注意事项
1、对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有必然的浓度,一般稀释度不应高出
1:20,抗体浓度过低,会以致产生的荧光过弱,影响结果的观察。
2、染色的温度和时间需要依照各种不同样的标本及抗原而变化,染色时间能够从10min
到数小时,一般30min已足够。染色温度多采用室温(25℃左右),高于37℃可加强染色
收效,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2℃的低温,延长染色时间。
低温染色过夜较37℃30min收效好的多。
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3、为了保证荧光染色的正确性,首次试验时需设置下述比较,以消除某些非特异性荧光染色的搅乱。
1)标本自觉荧光比较:标本加1-2滴,。
2)特异性比较(控制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性
抗体。
3)阳性比较:已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
若是标本自觉荧光比较和特异性比较呈无荧光或弱荧光,阳性比较和待检标本呈强荧
光,则为特异性阳性染色。
4、一般标本在高压***灯下照射高出3min,就有荧光减弱现象,经荧光染色的标本最好
在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。
免疫荧光染色(间接法)
1、切片固定后用毛细滴管吸取经合适稀释的免疫血清滴加在其上,置于染色盒中保持
必然的湿度,37℃作用30min。,10min,用吸水吸去或
吹干余留的液体。
2、再滴加间接荧光抗体(如兔抗人-球蛋白荧光抗体等),同上步骤,染色30min,
37℃,缓冲盐水洗两次10min,搅拌,缓冲甘油封固,镜检。
比较染色:①抗体比较:用正常兔血清或人血清代替免疫血清,再用上法进行染色,结
果应为阴性。②抗原比较:即类属抗原染色,亦应为阴性。③阳性比较。
间接法中上述方法称双层法(DoubleLayerMethod)。另一种称夹心法,即用未标记
的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合,再用该抗原之荧光抗体重叠结合其
上,而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在,方法步骤以下:
①切片或涂片固定后,置于染色湿盒内。
②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃,30min。
③缓冲盐水洗2次,每次5min,吹干。
④滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃,30min。
⑤如③水洗。
⑥缓冲甘油封固,镜检。
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细胞内抗原的检测-间接免疫荧光法
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细胞内抗原的检测过程与细胞表面抗原检测过程基本一致,可是在与一抗孵育前,需要起初对细胞用非离子去污剂进行透化办理。
【操作方法】
(1)取已固定好的细胞爬片或甩片或经过预办理的组织切片(白腊或冰冻切片);
(2)%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的细胞2min(室温),有些标本可能需要长达15min,时间视抗原而定;
3)余下步骤接上述“细胞表面抗原的检测-间接免疫荧光法”步骤(2);【注意事项】
1)在使用前,一抗二抗均应测试其合适的稀释度。
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2)多聚甲醛的固定是不牢固的,标本经多聚甲醛固定后,应再用去污剂办理,若是
标本在水溶液中浸泡的时间过长,则会使交联结构解体。因此,应防范固定后的标本在水溶液中浸泡的时间过长。
3)信号稍微的解决方法:
①提高一抗和二抗的浓度以加强敏感性,这必定测试各种浓度抗体的滴度;
②延长一抗和二抗的孵育时间。由于细胞染色时抗原吸附在固相载体上,抗原抗体结合
时间较在溶液中长。孵育时间可因实验设计作合适调整,但少于20min抗体和抗原几乎不能够
有效结合。在以上两点中,应探究出一个最正确条件以产生有效信号且保持优异的背景。这就
需要屡次试验,由于每组抗体和抗原的状况会有所不同样;
③改变检测方法,用共聚焦显微镜观察,可提高敏感性。
(4)背景不好的解决方法
细胞样本进行荧光染色时,背景问题主要来自两个方面,即非特异性染色和特异性
交织反应。
①非特异性吸附:非特异性吸附背景问题的产生与抗原抗体的特异性结合没关。即
一抗或二抗与样品相互作用而发生吸附,而不是与抗原发生特异性结合。
将所有抗体溶液或含蛋白的检测试剂用100,000′g离心30min以去除蛋白聚合物。
滴定一抗和所用的检测试剂,以确定能够产生合适信号的最低浓度。
固定后,用饱和量其实不被检测试剂结合的非特异性抗体封闭样品,有效的封闭液
包括5%的与标记二抗本源同样的同种血清、3%的BSA和3%的脱脂奶粉。
用上述封闭液稀释抗体和检测试剂。
*固定后,在所有的缓冲液及冲洗液中加入2%吐温-20。
缩短一抗或标记试剂的孵育时间。
充分冲洗(延长冲洗时间,重复次数)。
改变检测方法。②特异性背景:造成特异性背景问题的原因有三种因素,即污染抗体所致假阳性、
交织反应和样品中含有能与Ig结合的蛋白质。
如用多克隆抗体,应滴定抗体(假阳性)。
如用多克隆抗体,亲和纯化特异性抗体(假阳性)。
如用多克隆抗体,用合适的***肝脏粉吸取以阻抑假阳性。
换用其他抗体(交织反应及假阳性)。
武汉伊艾博有限公司
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