文档介绍：碱裂解法提取DNA的方法
碱裂解法提取质粒DNA
实验目的
1、掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法;
2、了解制备原理及各种试剂的作用。
实验原理
碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性,再将pH值调至中性使其复性,复性的为质粒DNA,而染色体DNA不会复性,缠结成网状物质,通过离心除去。
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份,通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子,重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取,本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的
两条互补链不会完全分离,,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
一、材料
含pUC19质粒的大肠杆菌,,离心管架,枪头及盒、卫生纸。
二、设备
微量移液器(20μl,200μl,1000μl),台式高速离心机,恒温振荡摇床,高压蒸汽消毒器(灭菌锅),涡旋振荡器,恒温水浴锅,双蒸水器,冰箱等。
三、试剂准备
1、 LB液体培养基:称取蛋白胨(Tryptone)10 g,酵母提取物(Yeast extract) 5g,NaCl 10g,溶于800ml去离子水中,,加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。
2. 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液:配成 100mg/ml水溶液,-20℃保存备用。
3. 溶液Ⅰ:50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH ),10mM EDTA(pH )。
1M Tris-HCl (pH ), EDTA(pH )10ml,,加ddH2O至500ml。在121℃高压灭菌15min ,贮存于4℃。
4. 溶液Ⅱ: NaOH,1% SDS。
2M NaOH 1ml,10%SDS 1ml,加ddH2O至10ml。使用前临时配置。
5. 溶液Ⅲ:醋酸钾(KAc)缓冲液,pH 。
5M KAc 300ml,冰醋酸 ,加ddH 2O至500ml。4℃保存备用。
6. TE:10mM Tris-HCl(pH ),1mM EDTA(pH )。
1M Tris-HCl(pH )1ml, EDTA(pH ),加ddH