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一、基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外DNA重组和转基因技术,赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,又叫做DNA重组技术。
(一)基因工程的基本工具
1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶)
(1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。
(2)功能:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有专一性。
(3)结果:经限制酶切割产生的DN***段末端通常有两种形式:黏性末端和平末端。
2.“分子缝合针”——DNA连接酶
(1)两种DNA连接酶(E•coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较:
①相同点:都缝合磷酸二酯键。
②区别:E•coliDNA连接酶来源于T4噬菌体,只能将双链DN***段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DN***段的末端,形成磷酸二酯键。
*比较有关的DNA酶
(1)DNA水解酶:能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸,彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基
(2)DNA解旋酶:能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链,作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意:使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外,在适当的高温(如94℃)、重金属盐的作用下,也可使DNA解旋。
(3)DNA聚合酶:能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。
(4)DNA连接酶:是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。
3.“分子运输车”——载体
(1)载体具备的条件:①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点,供外源DN***段插入。
③具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。
(2)最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外,并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
(3)其它载体:噬菌体的衍生物、动植物病毒
【解题技巧】 
(1)限制酶是一类酶,而不是一种酶。 
(2)限制酶的成分为蛋白质,其作用的发挥需要适宜的理化条件,高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 
(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶,目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次,共产生4个黏性末端或平末端。 
(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同,同一个DNA分子用不同的限制酶切割,产生的黏性末端一般不相同。 
(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外,不能破坏标记基因,以便于进行检测。
(二)基因工程的基本操作程序
第一步:目的基因的获取
目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因,目前被广泛提取使用的目的基因有:苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因(抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。 
获得目的基因的方法 
(1)从基因文库中获取目的基因: 
基本概念的理解: 
①将含有某种生物不同基因的许多DN***段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。 
②将某种生物体内的DNA全部提取出来,选用适当的限制酶,将DNA切成一定范围大小的DN***段,然后将这些片段分别与载体连接起来,导入受体菌的群体中储存,每个受体菌都含有了一段不同的DN***段。这个群体包含了这种生物的所有基因。这种基因文库叫基因组文库。 
③有些基因文库比较小,只包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库,如cDNA文库(用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段,与载体连接后储存在一个受体菌群中,这个受体菌群体叫做这种生物cDNA文库。) 
怎样提取:根据目的基因有关信息,例如,根据基因的核苷酸序列,基因的功能,基因在染色体的位置,基因的转录产物mRNA以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
⑵利用PCR技术扩增目的基因: 
原理:DNA双链复制的基本原理 
前提:一段已知目的基因的核苷酸序列,根据这一序列合成引物。 
条件:a..四种脱氧核苷酸 
 
(Taq酶) 
(一小段单链DNA或RNA,一般20~30个碱基,能与DNA母链的一段碱基序列互补配对)  
PCR技术扩增过程: 
DNA变性(90℃-95℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA 
b、复性(55℃-60℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链 
c、延伸(70℃-75℃):在Taq酶的作用下,从 引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链 
⑶人工合成: 
①反转录法: 以目的基因转录成的信使RNA为模板,反转录成互补的单链DNA,然后在酶的作用下合成双链DNA,从而获得所需的基因。
 目的基因转录成的mRNA 逆转录出单链DNA碱基互补配对双链DNA(目的基因) 
②根据已知的氨基酸序列合成DNA法: 
蛋白质中氨基酸的序列推测mRNA中的碱基序列推测DNA碱基序列目的基因
化学方法合成目的基因
第二步:基因表达载体的构建
:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。
:目的基因+启动子+终止子+标记基因
(1)启动子:是一段有特殊结构的DN***段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质。
(2)终止子:也是一段有特殊结构的DN***段,位于基因的尾端。
(3)标记基因的作用:是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
第三步:将目的基因导入受体细胞
:是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
:
将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是农杆菌转化法,其次还有基因枪法和花粉管通道法等。
将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。
将目的基因导入微生物细胞:原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,最常用的原核细胞是大肠杆菌,其转化方法是:先用Ca2+处理细胞,使其成为感受态细胞,再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。
,筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
第四步:目的基因的检测和表达
,方法是采用DNA分子杂交技术。
,方法是采用用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
,方法是从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原-抗体杂交。
。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
(三)基因工程的应用
植物基因工程:
主要用于提高农作物的抗逆能力(如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等)以及改良作物的品质和利用植物生产药物等方面。
(1)、抗虫转基因植物
目前防治作物虫害的发展趋势是从某些生物中分离出具有杀虫活性的基因,将其导入作物中,使其具有抗虫性。用于杀虫的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。
(2)、抗病转基因植物
引起植物生病的微生物称为病原微生物,主要有病毒、真菌和细菌等。抗病转基因植物所采用的基因使用最多的是病毒外壳蛋白基因和病毒复制酶基因;抗真菌转基因植物中可使用的基因有几丁质酶基因和抗***合成基因。
(3)抗逆转基因植物
目前科学家利用一些可以调节细胞渗透压得基因的基因,来提高农作物的抗盐碱和抗干旱能力;将鱼的抗冻蛋白基因导入烟草和番茄,提高其耐寒能力;将抗除草剂基因导入作物,使作物抗除草剂。
(4)利用转基因改良植物品质
利用转基因技术可以提高生物中的必需氨基酸的含量(如富含赖氨酸的转基因玉米转入的是富含赖氨酸的蛋白质编码基因)、延长贮存时间、改变花色等,从而提高作物品质。
动物基因工程:
提高动物的生长速度——转入外源生长素基因
改善畜产品的品质—--将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组,使奶牛分泌的乳汁中乳糖含量大大境地而其他营养成分不受影响。
转基因动物生产药物—--将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等填空组件重组在一起,通过纤维注射法导入哺乳动物受精卵中进而发育成转基因动物,如从乳汁中提取药物的乳腺生物反应器或乳房生物反应器,表达的药物如抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素等。
转基因动物作为器官移植的供体---猪油内脏构造与人相似且隐藏的病毒较少,科学家试图用猪来解决人类器官的来源。目前做大的问题是免疫排斥,解决办法是将器官供体基因组导入某种调节因子,以抑制抗原决定基因的表达,或设法除去抗原决定基因,再结合克隆技术培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
基因工程药物
利用转基因工程菌生产药物如细胞因子、抗体、疫苗、激素等。这些药物用来预防和治疗肿瘤。心血管疾病。传染病、糖尿病等。
蛋白质工程的概念
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。(基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质)蛋白质工程的途径是:预测蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。蛋白质工程在基因工程的基础上,是第二代基因工程。