文档介绍：汕头大学
硕士学位论文
副溶血弧菌VP L4-90活的非可培养状态的初步研究
姓名:孙作俤
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:胡忠
20090501
汕头大学硕士学位论文
摘要
徐怀恕等在 1982 年第一次提出了细菌“活的非可培养状态(viable but nonculturable
state,VBNC)”的概念,此后越来越多的报告阐明了细菌这种状态的存在。所谓细菌的
VBNC 状态是指长期处于不良环境条件下的细菌,用常规的固体平板培养方法不能培养出
来,但仍然具有代谢活性的一种特殊生理状态。处于该状态的致病菌,在一定条件下可以
复苏,并具有潜在的致病性。VBNC 状态作为微生物学的一个全新概念,受到了极大的关
注,它不仅对食品安全问题产生了新的考虑,而且对菌种保藏、活细菌的定义等都提出了
新的探讨。
副溶血弧菌是一种嗜盐的革兰氏阴性细菌,是大陆沿海地区食物中毒中最常见的一种
病原菌。本文选用副溶血弧菌 VP L4-90 作为研究 VBNC 状态的对象,探讨了其进入 VBNC
状态的条件,并进一步研究了 VBNC 状态副溶血弧菌的复苏现象及条件;建立了一种新型
的基于 PCR 的活菌检测方法,并将此方法运用于高温诱导的 VBNC 状态副溶血弧菌的检
测中。
VBNC 状态,分别用 AODC、DVC
和 PC 等细菌检测方法对诱导过程进行检测,验证了副溶血弧菌能够进入 VBNC 状态;并
对进入 VBNC 状态的副溶血弧菌的形态、遗传物质等进行了初步研究。
VBNC 状态的条件(温度、细菌的生长状况和培养密度)
进行了优化。结果发现稳定期的副溶血弧菌 VP L4-90 在低温贫营养条件下,较短的时间内
可以进入 VBNC 状态;高温下贫营养条件也能在短时间内诱导副溶血弧菌进入 VBNC 状
态;培养密度只对副溶血弧菌 VP L4-90 进入 VBNC 状态的时间上有所影响。
VBNC 状态细菌复苏的研究方面,利用最大或然法定量样品中可以复苏的细菌
数的结果说明,只有非常少数的 VBNC 状态细菌具有复苏的能力。复苏后,少量的活菌可
以利用死菌的营养进行快速的生长。
EMA 染料处理与 Real Time PCR 相结合,建立了一种新型的基于 PCR
的活菌检测方法——EMA-PCR。
,发现在 46℃副溶血弧菌一样也可以进入 VBNC 状态。进一步将 EMA-PCR
方法运用于高温诱导的实验中。虽然在高温的培养过程中细菌出现了大量的死菌,但是其
中也有小部分活的 VBNC 状态存在,本实验结果给食品安全和细菌检测提供了一个重要的
I
副溶血弧菌 VP L4-90 活的非可培养状态的初步研究
参考。
关键词:副溶血弧菌;活的非可培养状态;高温;复苏;EMA-PCR;
II
汕头大学硕士学位论文
Abstract
Since the original 1982 paper (Xu et al., 1982), more and more papers have been appearing
which describe various aspects of the phenomenon monly referred to as the “viable but
nonculturable (VBNC) state”. A great many pathogens, as well as nonpathogens, are now known
to enter this dormancy state, and its significance in medicine, bioremediation, the use of bacteria
as fecal indicators, and indeed in most microbiological studies where culturability is employed as
the (often sole) indicator of viability, is ing increasingly evident.
Bacteria in the VBNC state fail to grow on the routine bacteriologi