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细胞凝聚反响
【实验目的】
1、认识细胞的表面构造。
2、掌握细胞凝聚的原理。
3、掌握细胞凝聚实验的操作方法。
【实验资料与用品】
试剂:PBS缓冲溶液、%的***化钠溶液(生理盐水)
用具:酒精棉球、双凹片、载玻片、一般光学显微镜、托盘天平、滴管、离心管
资料:兔子静脉血
【实验原理】
凝聚素
凝聚素(lectin)是一类含糖的(少量例外)并能与糖专一联合的蛋白质,它拥有凝聚
细胞和刺激细胞分裂的作用。当前已发现近千栽种物中含有凝聚素,在各样真菌、无脊椎动
物、脊椎动物、人体的各样组织和器官中及某些病毒体内也含有凝聚素。常用的为植物凝聚
素,往常以其被提取的植物命名,凝聚素为它们的总称。
在细胞表面,构成细胞膜的糖脂和糖蛋白伸出寡糖链,形成细胞外被(糖萼)。凝聚素
使细胞凝聚是因为它与细胞表面的糖分子连结,在细胞间形成“桥”的结果,加入与凝聚素
互补的糖能够克制细胞的凝聚。
细胞凝聚
细胞凝聚是指细胞相互齐集在一同,成为一簇不规则的细胞团,当前以为,细胞间的联
系、细胞的生长和分化、肿瘤的发生与免疫反响都与细胞表面的分枝状糖分子相关。
细胞凝聚的反响技术
1)直接凝聚反响技术
颗粒性抗原与相应的抗体血清混淆后,在电解质的参加下,经过一准时间,抗原抗体凝
集成肉眼可见的凝聚块,这类现象称为凝聚反响。血清中的抗体称为凝聚素。抗原称为凝聚
原。细菌或其余凝聚原都带有同样的电荷(阴电荷),在悬液中互相排挤而呈平均的分别状
态。抗原和抗体相遇后,因为抗原和抗体分子表面存在互相对应的化学基团,因此发生特异
性联合,称为抗原抗体复合物,因为抗体与抗原联合,降低了抗原分子间的排挤力,抗原表
面的亲水基团减少,此时已有凝聚趋向,在电解质参加下,中和了抗原抗体复合物的大多数
电荷,使之失掉了经典排挤力,分子间互相吸引,凝聚成较大颗粒。出现了肉眼可见的凝聚
反响。
(2)间接凝聚反响技术
可溶性抗原(或抗体)吸附于免疫学反响没关的颗粒表面上,当这些致敏的颗粒与相应
的抗体(或抗原)相遇时,就会产生特异性的联合,在电解质的参加下,这些颗粒就会发生
凝聚现象。这类借助于载体的抗原抗体凝聚现象就叫做间接凝聚反响技术。
载体
拥有吸附抗原(抗体)的载体好多,如聚苯乙烯乳胶、白陶土、活性炭、人和多种动物
的红血球、某些细菌等。
优秀的载体有以下几点基本要求:
1)在生理盐水或缓冲液中无自凝现象;
2)大小平均;
3)比重与介质相像,短时间内不积淀;
4)无化学或血清学活性;
(5)吸附抗原(或抗体)后,不影响其活性;
当前使用最宽泛的是人的O型红血球和绵羊红血球。后者使用更广,因其根源方便,另
外绵羊红血球的表面有大批的糖蛋白受体,极易吸附某些抗原物质,吸附性能好,且大
小平均一致。
【实验步骤】
一、大概流程
取兔子静脉
土豆凝聚素+红
PBS+红细胞悬
血配置1%
细胞悬液混淆
液混淆(比较)
红细胞悬液
显微镜下察看摇摆5-10min
察看
二、详细操作
1、称取土豆去皮块茎2g,加10mlPBS缓冲液,浸泡24小时,浸出的粗提液中即含有可溶性
土豆凝聚素。(老师已做好)
2、抽取兔子静脉血液(加抗凝剂)1ml,加生理盐水3ml,在1000r/min条件下,离心5min,
重复3次离心,最后按压积红细胞体积用生理盐水配成1%红细胞悬液。
3、分别用滴管汲取土豆凝聚素和1%红细胞悬液各一滴,置双凹片左孔内,充分混匀。
4、同时分别用滴管汲取PBS缓冲液和1%的红细胞悬液各一滴,置双凹片右孔内,充分混匀,
做比较实验。
5、摇摆5—10min后,察看有无发生细胞凝聚并置显微镜下察看。
【实验结果与剖析】
、图2所示:刚开始计不时,双侧溶液均无凝聚现象;4min左右时,可看到双凹片左
侧溶液中出现凝聚现象,一部分血细胞在中央齐集呈沙粒状,溶液四周较澄清;而右边溶液
无凝聚现象。说明土豆凝聚素能够使血液发生凝聚,而PBS缓冲液则不可以。
图1:刚开始时双凹片双侧溶液对照图
图2:4min时双凹片双侧溶液对照图
、图4所示:在10×10显微镜下察看,可看到左边溶液中血细胞齐集,凝固成块状,
而右边溶液中血细胞分别平均,呈透明状。
图3:(10×10)显微镜下察看图(左边)图4:(10×10)显微镜下察看图(右边)
,可较清楚的看到血细胞齐集在一同,还可看到少量未发生凝
集的血细胞;
高倍镜下(10×40),
察看到的凝聚现象
由以上的察看可知:细胞凝聚的时间较快,4min左右就能够发生显然凝聚现象;细胞凝
集的时间也遇到土豆凝聚素的浓度,以及血细胞的浓度影响,一般来说,凝聚素的浓度越高,
血细胞的浓度越高,细胞凝聚的时间也会越短,凝聚现象也越显然,但在本次实验中未进行
不一样浓度对凝聚时间的影响的实验;从空白比较还能够看出,细胞发生凝聚时凝聚素必不行
少的,没有细胞凝聚素,细胞几乎不发生凝聚。
实验反省:
第一次滴加完溶液后,在晃动双凹片的过程中因操作不娴熟,使两个孔中的液体混到了
一同,所以从头滴加了一次;在使用双凹片刻要注意摇动的技巧,不行前后或左右单调地摇
动,应当一手固定,一手成环形方向摇动,使凹槽内的液体转动起来,同时注意滴加的液体
不宜过多,若加多了可用吸水纸吸掉部分剩余液体,防止两个凹槽内的液体互相接触;
【注意事项】
,做好适合标志;
,免得使双凹片的2个孔中的液体混淆;
摇摆双凹片刻要注意摇动的技巧,不行前后或左右单调地摇动,应当一手固定,一手成环形方向摇动,使凹槽内的液体转动起来;
显微镜下察看时,注意淀粉球和细胞的划分;淀粉球呈白色球状,略大于细胞;
实验过程中若凹槽内的水分蒸发过多,应实时增补PBS缓冲液,免得察看不到实验现象;
换用高倍镜下察看时,注意防止污染镜头,若液体过多,应用吸水纸汲取部分液体在进行高倍镜下的察看;
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