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专题1基因工程
基因工程的观点
基因工程是指依据人们的梦想(定向变异),进行严格的设计,经过体外(体内、体外)DNA重组和转基因技术,给予生物以新的遗传特征,创建出更切合人们需要的新的生物
种类和生物产品。基因工程是在分子水平长进行设计和施工的,又叫做DNA重组
技术。
基因工程技术的原理:基因重组
基因工程的长处:(1)目的性强,能够定向的改变生物的质量。(2)战胜远缘杂交不亲和。
“分子手术刀”——限制酶(全称:限制性核酸内切酶)(1)主要根源:原核生物。
(2)功能:能够辨别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列(被辨别序列具反向对称特色),而且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,所以拥有专一性。
(3)结果:经限制酶切割产生的DN***段尾端往常有两种形式:黏性尾端和平尾端。
(4)与解旋酶的差异:
解旋酶:断开碱基对间氢键
限制酶:断开两个脱氧核苷酸之间(即磷酸与脱氧核糖之间)的磷酸二酯键
“分子缝合针”——DNA连结酶
两种DNA连结酶(E·coliDNA连结酶和T4DNA连结酶)的比较:
①同样点:都连结磷酸二酯键。
②差异:E·coliDNA连结酶根源于T4噬菌体,只好将双链DN***段互补的黏性尾端之间的磷酸二酯键连结起来;而T4DNA连结酶能缝合两种尾端,但连结平尾端的之间的效率较低。
与DNA聚合酶作用的异同:
DNA聚合酶:只好将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的尾端,形成磷酸二酯键。
DNA连结酶:连结两个DN***段的尾端,形成磷酸二酯键。
“分子运输车”——运载体
(1)运载体具备的条件:①拥有一至多个限制酶切点,供外源DN***段插入。
②能在受体细胞中复制并稳固保留。
③拥有标记基因,供重组DNA的判定和选择。
④能在受体细胞中稳固保留(对受体细胞无害),大小适合。
(2)最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、构造简单的、独立于细菌染色体以外,并具
有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。
(3)其余载体:λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。
(4)在进行基因工程操作中,真实被用作载体的质粒,都是在天然质粒的基础长进行过人工改造的。
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步骤:1、获取目的基因,2、基因表达载体的建立,
3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测和判定。
第一步:获取目的基因
目的基因范围:编码蛋白质的基因、拥有调控作用的因子。
目的基因根源:自然界获取或人工合成
自然界获取:采纳直接分别法---用适合的限制酶办理获取。工作量大,多为原核基因根源。
人工合成:反转录法和化学合成法。操作复杂,基因构造不完好,多为真核基因的根源。
补:基因构造
原核基因、真核基因均有两种地区:编码区、非编码。但真核基因的前者是
不连续的,分为外显子和内含子。
目的基因的(大批)获取方法(1)从基因文库获取
:基因组文库、部分基因文库
:据目的基因的有关信息,以及基因的表达产物蛋白质等特征。:
基因组文库的目的基因根源于自然界直接分别法获取。
cDNA文库的目的基因根源于反转录法人工合成。
:书P10表格
2)PCR(多聚酶链式反响的缩写)技术.(发明人:穆里斯等人):DNA双链复制
:体外复制,指数增添,需要(需要、不需要)模板。:
第一步:高温解链(变性):加热至90~95℃,双链DNA受热解成单链(不需解旋酶);第二步:低温引物(复性):冷却到55~60℃,引物与模板单链DNA互补联合;
第三步:中温复制(延长):加热至70~75℃,热稳固DNA聚合酶从引物开端互补链的合成。
第四步:重复一至三步。
:模板为目的基因,原料为四种脱氧核苷酸,酶为热稳固DNA聚合酶
,能量由ATP直接供给。
(3)化学合成法人工合成(经过DNA合成仪)
特色:
第二步:基因表达载体的建立
目的:将目的基因导入受体细胞,并使目的基因在受体细胞中稳固存在,而且能够遗传至下一代(复制),使目的基因能够表达和发挥作用。
构成:目的基因+启动子+停止子+标记基因。(具复制原点)
(1)启动子:是一段有特别构造的DN***段,位于基因的首端(编码区上游的非编区),含
有RNA聚合酶辨别和联合的位点,有助于RNA聚合酶驱动基因的编码区转录出
mRNA,最后获取所需的蛋白质。
(2)停止子:也是一段有特别构造的DN***段,位于基因的尾端(编码区下游的非编区)。(3)标记基因的作用:是为了判定受体细胞中能否含有目的基因,进而将含有目的基因的细
胞挑选出来。常用的标记基因是抗生素基因,别的还有荧光蛋白基因。
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第三步:将目的基因导入受体细胞
转变的观点:是目的基因进入受体细胞内,而且在受体细胞内保持稳固和表达的过程。
常用的转变方法:
将目的基因导入植物细胞:采纳最多的方法是农杆菌转变(该方法主要针对双子叶植物
植物和裸子植物,而对大部分票据叶植物无
效。利用农杆菌Ti质粒上的T-DNA可整合到受全细胞染色体DNA上的特征)。
其次还有基因枪法(又称微弹轰击法),以及花粉管通
道等。
将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是显微注射法。此方法的受体细胞多是
受精卵。
将目的基因导入微生物细胞:原核生物作为受体细胞的原由是:生殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。
最常用的原核细胞是大肠杆菌,其转变方法是:先用钙离子办理细胞,使其成为感觉态细胞,再将重组表达载
体DNA分子溶于缓冲液中与感觉态细胞混淆,在必定的温度下促使感觉态细胞汲取DNA分子,达成转变过程。
,需利用标记基因挑选含有基因表达载体受
体细胞。
第四步:目的基因的检测和判定
分子水平的检测
(1)第一要检测转基因生物的染色体DNA上能否插入了目的基因
方法/技术:DNA分子杂交技术
基因探针:用放射性同位素或荧光分子等标记的目的基因单链。
检测对象:DNA存在标记:出现杂交带。
(2)其次还要检测目的基因能否转录出了mRNA
方法/技术:DNA分子杂交技术
基因探针:用放射性同位素或荧光分子等标记的目的基因单链。
检测对象:mRNA。存在标记:出现杂交带。
(3)最后检测目的基因能否翻译成蛋白质
方法/技术:抗原--抗体杂交存在标记:出现杂交带。
目的基因翻译成的蛋白质相当于抗原。
2..个体生物学水平的判定
如做抗虫的接种实验:将虫子放在转基因植物上,察看虫子能否因摄食植物死亡,
以确立转基因抗虫植物能否出现抗虫性状及抗性的程度。
又如,有的基因工程产品需与天然产品的功能进行活性比较,以确立转基因产品的
功能活性能否与天然产品同样。
注意:书中提到的各样应用中,目的基由于何?
植物基因工程应用:
(1)抗虫、抗病等抗逆能力的提升。(2)改进农作物的质量。(3)利用植物生产药物等。
动物基因工程:
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(1)提升动物生长速度。(2)改良畜产品质量。(3)用转基因动物生产药物。(4)器官移植的供体
乳腺生物反响器(乳房生物反响器):药用基因(目的基因)+乳腺蛋白基因的启动子
基因工程药物(扰乱素是一种糖蛋白。)
工程菌:用基因工程的方法,使外源基因获取高效率表达的菌类细胞株系一般称为工程菌。
基因治疗:把正常的外源基因导入病人体内,使该基因表达产物发挥作用。是治疗遗
传病的最有效的手段。
基因芯片的应用(DNA分子杂交技术):亲子判定、犯人认定、尸体鉴别、疾病诊疗等。
1、蛋白质工程的观点
蛋白质工程是指以蛋白质的构造规律及其与生物功能的关系作为基础,经过
基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的(自然界没有的)蛋白
质,以知足人类的生产和生活的需求。是在基因工程的基础上延长出来的。(基因工程
在原则上只好生产自然界已存在的蛋白质)
2、过程
预期蛋白质功能--->设计蛋白(空间)构造---->改造有关基因----->基因工程
实现预期
进展
成功例子不多,主假如由于蛋白质发挥功能一定依靠于正确的高级(空间)构造,而当前科学家们对此认识的还很不够。
专题2细胞工程
细胞工程:是指导应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法,经过细胞水平
或细胞器水平上的操作,依据人的意向来改变细胞内的遗传物质或获取细胞产品的一门
综合科学技术,
依据操作对象不一样分为:植物细胞工程,动物细胞工程
操作水平:细胞水平的操作(基因工程为分子水平的操作)
(属于无性生殖)
有关知识回首:
1、无性生殖最大长处:保持优异品种的遗传特色。
2、理论基础(原理):细胞全能性(拥有某种生物所有遗传信息的任何一个细胞都拥有发育成完好生物体的潜能,也就是说,每个生物细胞都拥有全能性的特色,)
3、拥有全能性的原由:分化的细胞,仍拥有形成完好植株所需要的所有基因。
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理论上,生物的任何一个细胞都拥有发育成完好植物的潜力,可是在生物的生长发育过程中,细胞其实不会表现出全能性,而是分化成各样器官和组织,是由于在特定的时间和空间条件下,基因选择性表达的结果。
4、全能性表达的难易程度:受精卵>生殖细胞>干细胞>体细胞;植物细胞>动物细胞
一、植物细胞工程的基本技术:植物组织培养,植物体细胞杂交技术
(一)植物组织培养技术(最基本技术)
:细胞全能性
:
离体的植物器官、组织或细胞(脱分化)愈伤组织(再分化)胚状体植物体
(外植体消毒)生长素及细胞分裂素生长素及细胞分裂素(试管苗)
(避光)(给光)
植物全能性表达的条件:离体的,供给人为条件(营养,激素,适合的外界条件)
愈伤组织:细胞摆列松散而无规则是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞
(1)资料:离体、消毒、分化程度较低
(2)环境:无菌、避光-->给光
(3)培养基:含有:无机营养(水、无机盐),小分子有机物,植物激素,维生素。
固体培养基(琼脂),
地位:是培养转基因植物、植物体细胞杂交培养植物新品种的最后一道工序。是植物细胞工程的最基本技术
(二)植物体细胞杂交技术
(1)过程:
原生质体系备细胞交融
杂种细胞挑选细胞培养(组织培养技术)植物判定
植物重生
重点:
去细胞壁:纤维素酶和果胶酶
引诱交融的方法:物理法包含离心、振动、电激等。
化学法:用聚乙二醇(PEG)作为引诱剂。
:重生出细胞壁。
(2)意义:战胜了远缘杂交不亲和的阻碍。打破特种之间的生殖隔绝,扩大遗传重组范围。
二、植物细胞工程的应用:
研究植物科学理论的重要手段,微型生殖、培养脱毒苗、生产人工种子、培养新品种(单倍体育种)、转基因植物的培养,细胞产物的工厂化生产。
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重点:
1、微型生殖的长处:能够保持优异品种的遗传特征,能够高效快速地实验种苗的大批生殖
2、人工种子的长处:无性生殖,完好保持优异品种的遗传特征,不受季节限制,方便运输及储藏
3、单倍体育种的长处:极大缩短了育种的年限,节俭了大批的人力物力。
常用的技术手段:动物细胞培养(基础技术),动物细胞核移植,动物细胞交融(生产单克隆抗体)。
(1)观点:动物细胞培养就是从动物机体中拿出有关的组织,将它分别成单个细胞,而后放
在适合的培养基中,让这些细胞生长和生殖。
(2)原理:细胞增殖(有丝分裂)
(3)动物细胞培养的流程:取动物组织块(动物胚胎或幼龄动物的器官或组织)→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶办理分别成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代
培养→贴满瓶壁的细胞从头用胰蛋白酶或胶原蛋白酶办理分别成单个细胞后分瓶,进行传代培养。
细胞贴壁和接触克制:悬液中分别的细胞很快就贴附在瓶壁上,称为细胞贴壁。细胞数目不停增加,当贴壁细胞分裂生长到表面互相克制时,细胞就会停止分裂增殖,这
种现象称为细胞的接触克制。
(4)动物细胞培养需要知足以下条件
①无菌、无毒的环境:培养液应进行无菌办理。往常还要在培养液中增添必定量的抗生素,
以防培养过程中的污染。别的,应按期改换培养液,防备代谢产物积
累对细胞自己造成危害。
②营养:合成培养基成分:糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。往常还需加入
血清、血浆等天然成分。含有天然成分的培养基称天然培养基。
③温度:适合温度:℃+℃;pH:~。
④气体环境:95%空气+5%CO2。O2是细胞代谢所必要的,CO2的主要作用是保持培养液的pH。
(5)动物细胞培养技术的应用:制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各样细胞。
动物体细胞核移植技术和克隆动物
(1)哺乳动物核移植能够分为胚胎细胞核移植(比较简单)和体细胞核移植(比较难)。
(2)体细胞核移植的大概过程是:(下列图)
(3)采纳去核卵(母)细胞的原由:
①卵(母)细胞比较大,简单操作;
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②卵(母)细胞细胞质多,营养丰富;
③细胞质中合成与分裂分化有关的物质能刺激交融后重组细胞进行分裂分化。
(4)体细胞核移植技术的应用:
①加快牲畜遗传改进进度,促使良畜群繁育;②保护濒危物种,增大存活数目;
③生产宝贵的医用蛋白;④作为异种移植的供体;
⑤用于组织器官的移植等。
(5)体细胞核移植技术存在的问题:
克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺点等。
动物细胞交融
(1)定义:动物细胞交融也称细胞杂交,是指两个或多个动物细胞联合形成一个细胞的过程。
交融后形成的拥有本来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞,称为杂交细胞。(2)原理:动物细胞交融与植物原生质体交融的原理基真同样:细胞膜的流动性
(3)方法:引诱动物细胞交融方法的与植物原生质体交融的方法近似,常用的引诱要素有聚
乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。
(4)意义:战胜了远缘杂交的不亲和性,成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新
品种培养的重要手段。
(5)动物细胞交融与植物体细胞杂交的比较:
比较项目
细胞交融的
细胞交融的
引诱手段
用法
原理
方法
植物体细
细胞膜的流
去除细胞壁
物理:离心、电刺激、振动,战胜了远缘杂交的
胞杂交
动性、植物细
后引诱原生
化学:聚乙二醇等试剂引诱
不亲和性,获取杂
胞的全能性
质体交融
栽种株
动物细胞
细胞膜的流
使细胞分别
除应用植物细胞杂交锋段
制备单克隆抗体的
交融
动性
后引诱细胞
外,还可利用灭活的病毒诱
技术之一
交融
导
单克隆抗体
(1)抗体:一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分别出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
(2)单克隆抗体的制备过程:
特定
抗原
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(3)杂交瘤细胞的特色:既能大批生殖,又能产生专一的抗体。(4)单克隆抗体的长处:特异性强,敏捷度高,并能大批制备。(5)单克隆抗体的作用:
①作为诊疗试剂:正确辨别各样抗原物质的细微差异,并跟必定抗原发生特异性联合,拥有正确、高效、简略、快速的长处。
②用于治疗疾病和运载药物:主要用于治疗癌症治疗,可制成“生物导弹”,也有少许用于治疗其余疾病。
专题3胚胎工程
胚胎工程:是指对动物初期胚胎或配子所进行的多种显微操作和办理技术,如胚胎移植、体外受精、胚胎切割、胚胎干细胞培养等技术。经过办理后获取的胚胎,还需移植到雌性动物体内生产后辈,以知足人类的各样需求。
胚胎工程的很多技术,实质是在体外条件下,对动物自然受精和初期胚胎发育条件进行的模拟操作。
(一)体内受精和初期胚胎发育
1、精子的发生
(1)场所:睾丸(精巢)
(2)时间:初情期---生殖机能衰败
(3)阶段:(4)精子的外形:
似蝌蚪,分头,颈,尾三部分。不
同动物精子形态相像,大小与动物的体型
大小没关。
(5)变形:
细胞核----精子头的主要部分
高尔基体----顶体
中心体-----尾部
线粒体----鞘膜
其余物质---原生质滴---零落
2、卵子的发生
(1)场所:卵巢
(2)时间:性别分化此后(胎儿期)---精子与卵子在发生时间上的差异是重要的差异
减数第一次分裂是在雌性动物排卵前后达成的,其结果产生一个次级卵母细胞和第一极体,进入输卵管,准备与精子受精(不一样的动物排卵的时间不一样)。
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排卵是指卵子卵泡从中排出。
减数第二次分裂是在精子和卵子联合的过程中达成的,当卵黄膜和透明带的空隙能够察看到两个极体时,说明卵子已经达成了受精,这是判断卵子能否受精的重要标记。
(3)过程
3、受精:
(1)场所:雌性的输卵管内
(2)过程:
准备阶段:
①精子获能:刚排出的精子不可以立刻与卵子受精,一定在雌性动物生殖道发生相应的生理变化后,才能获取受精能力
②卵子的准备:动物排出的卵子成熟程度不一样,但都在要输卵管内进一步成熟,达到减数第二次分裂的中期,才具备与精子受精的能力。
受精阶段:
①获能的精子经过顶体反响挨次穿过放射冠、透明带,精子的头部与卵细胞膜,即卵黄膜接触,引起防备多精入卵的第一道屏障:透明带反响。
②两个细胞的细胞膜交融,引起第二道屏障卵黄膜关闭作用。同时卵子开始持续减数第二次分裂,所以,此时可察看到受精作用的标记,即精子入卵的标记:在透明带和卵黄膜之间察看到两个极体;
③精子入卵后,形成雄原核,同时卵细胞形成雌原核。雌雄原核的交融标记着受精作用达成。
4、动物胚胎发育的基本过程
(1)卵裂期:细胞有丝分裂,细胞数目不停增添。胚胎中有机物种类增添,DNA数目增添,
但胚胎的整体体积其实不增添,或略有减小。每个细胞体积变小。细胞未分化
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