文档介绍：选修3《现代生物科技专题》
专题1   基因工程
基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望(定向变异),进行严格的设计,通过体外(体内、体外)DNA重组和转基因技术,赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在分子水平上进行设计和施工的,又叫做 DNA重组技术。
基因工程技术的原理: 基因重组
基因工程的优点:(1)目的性强,能够定向的改变生物的品质。(2)克服远缘杂交不亲和。
基因工程的基本工具
1.“分子手术刀”——限制酶(全称:限制性核酸内切酶)
(1)主要来源: 原核生物。
(2)功能:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列(被识别序列具反向对称特点),并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有专一性。
(3)结果:经限制酶切割产生的DN***段末端通常有两种形式: 黏性末端和平末端。
(4)与解旋酶的区别:
解旋酶:断开碱基对间氢键
限制酶:断开两个脱氧核苷酸之间(即磷酸与脱氧核糖之间)的磷酸二酯键
2.“分子缝合针”——DNA连接酶
(1)两种DNA连接酶(E·coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶)的比较:
①相同点:都连接磷酸二酯键。
②区别:E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体,只能将双链DN***段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末端的之间的效率较低。
与DNA聚合酶作用的异同:
DNA聚合酶:只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键。
DNA连接酶:连接两个DN***段的末端,形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——运载体
(1)运载体具备的条件:①具有一至多个限制酶切点,供外源DN***段插入。
②能在受体细胞中复制并稳定保存。
③具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。
④能在受体细胞中稳定保存(对受体细胞无害),大小合适。
(2)最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外,并具有自我复制能力的很小的双链环状 DNA分子。
(3)其它载体: λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。
(4)在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒,都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
步骤:1、获取目的基因, 2、基因表达载体的构建,
3、将目的基因导入受体细胞, 4、目的基因的检测和鉴定。
第一步:获取目的基因
:编码蛋白质的基因、具有调控作用的因子。
:自然界获得或人工合成
自然界获得:采取直接分离法---用适当的限制酶处理得到。工作量大,多为原核基因来源。
人工合成: 反转录法和化学合成法。操作复杂,基因结构不完整,多为真核基因的来源。
补:基因结构
原核基因、真核基因均有两种区域: 编码区、非编码。但真核基因的前者是不连续的,分为外显子和内含子。
(大量)获取方法
(1)从基因文库获取
:基因组文库、部分基因文库
:据目的基因的有关信息,以及基因的表达产物蛋白质等特性。
:
基因组文库的目的基因来源于自然界直接分离法获得。
cDNA文库的目的基因来源于反转录法人工合成。
:书P10表格
(2)PCR( 多聚酶链式反应的缩写)技术.(发明人:穆里斯等人)
: DNA双链复制
: 体外复制, 指数增加, 需要(需要、不需要)模板。
:
第一步:高温解链(变性):加热至90~95℃,双链DNA受热解成单链(不需解旋酶);
第二步:低温引物(复性):冷却到55~60℃,引物与模板单链DNA互补结合;
第三步:中温复制(延伸):加热至70~75℃,热稳定 DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
第四步:重复一至三步。
:模板为目的基因,原料为四种脱氧核苷酸,酶为热稳定DNA聚合酶,能量由 ATP 直接提供。
(3)化学合成法人工合成(通过DNA合成仪)
特点:A. 基因较小 B. 核苷酸序列已知 C. 不需模板
第二步:基因表达载体的构建
目的:将目的基因导入受体细胞,并使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至
下一代(复制),使目的基因能够表达和发挥作用。
: 目的基因+启动子+终止子+ 标记基因。(具复制原点)
(1)启动子:是一段有特殊结构的DN***段,位于基因的首端(编码区上游的非编区),含
有RNA聚合酶识别和结合的位点,有助于RNA聚合酶驱动基因的编码区转录出
mRNA