文档介绍：中国协和医科大学
博士学位论文
用改进的RERS方法富集与筛选Apo(a)-Plasminogen基因簇中的
调节片段
姓名:吕湘
申请学位级别:博士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:梁植权;刘德培
用改进的方法富集与筛选一Ⅲ基因簇中的调节片段摘面对气象万千的外部环境和自身分化、发育的需要,细胞中必然存在一个极为精密的表达调控网络,时刻监测外来和自身因素的变化并作出反应,实现基因间协调有序的关系,维持细胞乃至个体的稳定状态和发展的需要。了解这个网络的结作用元件与反式作用因子之间的相互作用是染色质重塑和基因转录调节的基础。筛现有的研究方法难以大量筛选、鉴定鹘谠<窃谏秆调节片段高效筛选和鉴定骺卦<姆椒ǎ匀皇悄壳白B嫉骺匮芯康牡蔽裰薄本实验室在对原有的全基因组际踅懈慕幕∩希岷夏鹤柚褪笛椋建立了筛选鹘谄蔚男路椒,F浠驹硎峭üɑ蜃镈随机打断,与幼酉嗔蠼腥ɑ蜃镕扩增、标记,回收笥业腄片段作为探针,与细胞粗提物结合后进行聚丙烯酰***凝胶电泳,回收阻滞带俅进行┰觯魑P乱宦帜鹤柚褪笛榈奶秸耄牒舜痔嵛镌俅谓心旱ㄖ褪围地富集、筛选基因组中的调控片段。能筛选具有细胞特异结合模式的构组成、各组件间相互识别的方式及其变化,是后基因组时代的主要任务之一。转录水平的调节是基因表达调控网络中最重要的环节。已有研究表明呈选、鉴定基因组中的调节片段和它们相应的岷系鞍祝髡庑┰<慕峁褂功能关系,是基因调控研究的主要内容。时,或者效率不高,不能快速、大量地筛选基因组中的鹘谠<,利用常规的纯化方法很难获得足以进行氨基酸序列分析或抗体制备的纯化蛋白质。目前已克隆的转录因子不多,对这些因子的表达模式和坏鞍字氏嗷プ饔霉媛缮腥弊愎坏难芯俊R虼耍⒁恢帜茉诖蠓段验。如此重复多轮,不断富集可与细胞核粗提物结合的⒏缓鹘谄段的糠治目猓又猩秆〕瞿苡牒说白蕴匾旖岷虾途哂邢赴匾旖崽J降鹘谄巍S肫渌延械姆椒ㄏ啾龋庵址椒ň哂幸韵掠诺悖芸焖佟⒋蠓节片段。操作简单,不需要纯化的转录园子或相应的抗体,也不用其它特殊材中国协和医科大学博士学位论文
料和试剂。作为大范围内初步筛选鹘谄蔚姆椒ǎ瞧渌椒岩宰嘈У摹后将此方法应用于包含载脂蛋白基因簇拇笃蜝妇斯と旧测序结果中的部分片段存在突变。所富集的片段定位问题没有很好地解决。身竞争后变化,克服了克隆挑选过程中的随机性,有利于对弱势富集片段的筛选。大量制备号克隆的但因为研究的对象是基因组,筛选的范围太大,在针对性上有一定的欠缺。其希蟠笏跣×松秆〉姆段В喽蕴岣吡苏攵孕浴5ǜ梅椒ㄖ腥源嬖谝恍┪纯服的问题:富集到的调节片段的进一步筛选工作效率不高:以对单个片段依次进行克隆、自身竞争分析和转入报告载体承接上游高效富集的产物显然费时费力。只有部分片段可被正确定位。这两个问题可能是富集过程中┰龃问ǘ嗨隆仍有一定的随机性。针对以上问题,本研究进行了一些新的改进,包括直接在报告基因载体上构建研究对象的亚克隆文库,避免不必要的反复克隆和引入整体自身竞争的方法等。并将该方法应用于虼乇泶锏骺相关顺式元件的筛选工作之中。由于各克隆自身竞争的结果是通过与亚克隆文库的差示杂交分析同时得到显示,使调节片段的进一步筛选工作也实现了高通量,应用于基因组范围的筛选愈能显示其优越性。挑选到的自身竞争阳性克隆来自亚克隆文库,其中的插入片段没有经过多轮的反复回收和扩增,序列的保真度和定位问题得以解决,克隆片段的长度也可根据需要进行调整,不再受凝胶阻滞分离范围的限制。另外,从杂交结果中可以一目了然地观察狤返母患Ч白本研究包含以下四部分内容:构建人狝籔基因簇的物理图谱:小量制备人一虼匮粜缘母鰾克隆寐龀场凝胶电泳确定分子量。并通过┰龆悦扛鲅粜钥寺〗谐醪蕉ㄎ唬选择其中最大最完整的克隆进行多种限制性内切酶分析和部分酶切定位。在霭没虼氐腂克隆中,最长的号克隆含有一段约片段,定位分析发现其中包含了从基因峁褂蛑颉⒗郟基因酥涞男蛄校茨芨哺茿因的⒍恕K艺獠⒉环涟帽痉椒ǘ云渌呈皆<醒芯俊通过狤房焖俑患鹘谄渭罢遄陨砭赫鵈迦肫危蚨系左右,加上连接子后进行┰龊捅昙牵厥的片段,作为探针与赴舜痔嵛结合进行凝胶阻滞,回收阻滞带俅瓮ü齈标记进行新一轮和阻滞带回收,如此我愿患捎際细胞核粗提物结合的鹘谄巍8患中国协和医科大学博士学位论文
系中加入过量的冷探针进行自身竞争訤孀陨砭赫涮秸胱亚克隆文库的探针。富集和自身竞争的结果将在与文库杂交后显示出来。亚克隆文库的构建及调节片段克隆的筛选:籶靥宓腂坏悖趴寺〉难强寺∥目狻S梦淳患同一平板的亚克隆文库杂交,根据杂交强度的变化挑选克隆。本研究构建的文库包含有龅タ寺。筛哺钦鯞克隆基因簇片段大约四次。文库杂交的结果显示确有部分克隆循环富集后杂交信号增强而因簇中