MAPK、PI3K途径在蛇毒神经生长因子诱导PC12细胞分化的作用.doc

文档介绍：MAPK、PI3K途径在蛇毒神经生长因子诱导PC12细胞分化的作用
【关键词】神经生长因子;,PC12细胞;,细胞分化;,信号传导
摘要: 目的研究丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt途径在蛇毒神经生长因子(NGF)诱导PC12细胞分化中的作用。方法应用蛋白免疫印迹法分析p44/p42MAPK和Akt的磷酸化水平,并利用MAPK抑制剂PD98059和PI3K抑制剂LY294002,观察其对NGF诱导的PC12细胞形态学改变的影响。结果眼镜蛇毒NGF在10 ng/mL即可诱导PC12细胞长出突起,100,1000 ng/mL作用明显,呈剂量效应关系;NGF能有效刺激p44/p42MAPK、Akt的磷酸化;分别用特异抑制剂PD98059抑制MAPK活性,LY294002抑制PI3K活性后,NGF诱导的细胞分化均受抑制。结论蛇毒神经生长因子诱导PC12细胞的分化作用与p44/p42MAPK和PI3K/Akt途径相关。
关键词: 神经生长因子; PC12细胞; 细胞分化; 信号传导
ABSTRACT: ObjectiveTo investigate the role of mitogenactivated protein kinase(MAPK) and phosphoinositide 3kinase(PI3K)/Akt path venom. Methods The phosphorylation of p44/p42MAPK and Akt cobra venom can stimulate p44/p42MAPK and Akt phosphorylation and induce the differentiation of PC12 cells from 10 ng/mL to 1000 ng/mL. The differentiation of PC12 cells induced by NGF cobra venom relates to p44/p42MAPK and PI3K/Akt pathega公司),溶于DMSO配制成储存液。抗pERK、pAkt(ser)、βtubulin抗体,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗小鼠二抗,ECL检测系统(美国Santacruz公司)。多聚赖氨酸(PolyLLysine,美国Sigma公司);DMEM/F12培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);马血清(美国Hyclone公司)。
方法
细胞培养
PC12细胞生长于含10%马血清、5%胎牛血清的DMEM/F12培养液(37 ℃,,饱和湿度),常规传代。实验时培养器皿用多聚赖氨酸溶液包被,增加PC12细胞对培养器皿黏附力。
p44/p42MAPK、Akt磷酸化检测
对数生长期PC12细胞接种于6孔细胞培养板,用无血清培养液饥饿12 h,加入不同浓度的PD98059(,1,5,20,50和100 μmol/L)或LY294002(1,25,50和100 μmol/L)作用30 min,再以100 ng/mL NGF作用10 min。各组处理PC12细胞用冷PBS洗2次,加入细胞裂解液(含1 mm