文档介绍：酵母RNA提取
热酚法抽提酵母RNA
(1) 将酵母细胞培养在3ml选择性培养基中,30℃过夜旋转培养。
(2) 稀释过夜培养的菌液,重新在10ml培养基中培养细胞。
(3) ,收菌,4000rpm/min离心5min,弃培养基。
(4) 将细胞悬浮于400μl AE缓冲液(50mM Sodium Acetate,10mM EDTA )。
(5) 加入1/10体积的10% SDS,充分混合。
(6) 加入等体积在65℃预热的酸性酚(),混合。
(7) 65℃加热5min,冰上放置10min。
(8) 在室温下8000rpm/min离心10min。
(9) 取水相,加入等体积的酚/***仿/异戊醇(25∶24∶1),10000rpm/min离心8min。
(10) 取水相,加入等体积***仿/异戊醇(49∶1)10000rpm/min离心8min。
(11) 加入1/10体积3M ,,-20℃过夜沉淀。
(12) 沉淀样品于4℃离心5min,去除液体。
(13) 在冰上干燥RNA(放置15min),最后用适量DEPC水溶解RNA
下述两种方法分别提取酵母菌总RNA。
热酸性酚法提取酵母菌总RNA
参照文献[1]中的方法略有改进[3]。取 1ml 上述指数中期酵母培养液于4℃,1500× g离心3min,弃上清。菌体沉淀用1ml 冰冷水重悬转移至一个干净的离心管中,4℃离心 10s,弃上清。用 400μl TES 溶液重悬细胞沉淀,加400μl 酸性酚,激烈振荡 10s。65℃温育 30~60℃,其间不时振荡混合。冰浴放置5min,4℃,12000 ×
g离心 5min,水相移至一个干净的离心管中加 400μl 酸性酚,振荡,冰浴放置 5min,4℃,12000× g 离心5min,将水相移到一新管中加40μl 3mol/L乙酸钠()及1ml冰冷的无水乙醇,4℃,12000 ×g 离心 5min,在冰冷70% 乙醇中快速振荡洗涤RNA 沉淀,12000 × g 离心5min,RNA 沉淀用DEPC 水(后文记做 DEPC-H2O)重溶。
产物用于电泳分析或在-20℃保存。
TRIZOL 试剂盒提取酵母菌总RNA
按BBI 公司提供的TRIZOL 试剂使用说明书进行操作:取1ml 指数中期的酵母培养液,经计数后(酵母菌每1×108个加1ml TRIZOL)离心收集菌体,加入1ml TRIZOL,混匀,激烈振荡,室温放置5min,加入200μl ***仿,剧烈振荡30s,12000 × g 离心 5min,上层水相移入一个新离心管中,加入等体积的异丙醇,室温放置 5m i n ,12000 ×g 高速离心5min 弃上清,用 75% 乙醇洗涤 RNA沉淀2 次,用30μl
DEPC-H2O 溶解 RNA 沉淀。产物用于电泳分析或在-20℃保存。
TRIZOL 试剂盒改进方法提取酵母菌总RNA 在收集菌体之前加入1%的蜗牛酶30℃温育20min(对照组温育 5 0 m i n ),然后进行菌体离心收集加入 1 m lTRIZOL,混匀,振荡,冰浴5m