文档介绍：华中科技大学
硕士学位论文
扩展青霉脂肪酶基因克隆、密码子优化及表达
姓名:张正平
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:闫云君;徐莉
20090518
华中科技大学硕士学位论文
摘要
脂肪酶是一种重要的工业酶,在自然界中普遍存在,目前许多脂肪酶基因已被
克隆,并获得相应高效表达的工程菌。扩展青霉脂肪酶是一种中温碱性脂肪酶,可
在碱性条件下分解三酰甘油酯,在工业上有着广泛的应用。本研究以扩展青霉
(Penicillium expansum) 40356 为出发菌,利用 PCR 和 RT-PCR 克隆了扩展
青霉脂肪酶基因(PEL)及其开放阅读框(ORF),并对基因中低使用频率密码子进
行了优化,使其在异源宿主 Pichia pastoris GS115 中获得了理想的表达效果,并对
重组脂肪酶的酶学性质进行了初步研究。主要工作如下。
(1)分别利用 PCR 和 RT-PCR 克隆了扩展青霉(P. expansum) 40356
脂肪酶基因(PEL)及其开放阅读框(ORF)。序列分析显示该基因由 6 个外显子和
5 个内含子组成,基因全长 1140 bp,ORF为 858 bp,编码 286 个氨基酸残基,与
GenBank 中已报道的 PEL 基因序列的同源性为 99 %。
(2)外源蛋白的异源表达水平与多种因素有关,其中密码子偏爱性是重要影响
因素。为了获得高效表达的扩展青霉脂肪酶,利用重叠延伸 PCR(Over-lap extension
PCR)技术对 PEL 的 10 个氨基酸密码子和表达载体 pPIC9K α信号肽的 9 个氨
基酸密码子进行了优化,获得了改造过的脂肪酶基因 PELM 和表达载体pPIC9KM。
并构建了带有脂肪酶自身信号肽的 pPIC9K-PEL1 、 pPIC9KM-PELM1 、
-PEL1、-PELM1 和不带有脂肪酶自身信号肽的 pPIC9K-PEL2、
pPIC9KM-PELM2 六个重组质粒。表达载体经 Sal I 线性化后电转化至
GS115 中进行表达。经过 MD、MM、活性功能检测平板及 G418 筛选得到最佳毕
赤酵母 GS115 转化子,在摇瓶中甲醇诱导发酵 100h 后,利用 pNPP 比色法测得
发酵上清的酶活分别为 U/ml, U/ml, U/ml, U/ml, U/ml,
U/ml。发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析,透析产物经 SDS-PAGE 检测,发现
28 kDa 左右的特异性蛋白条带。
(3)对重组扩展青霉脂肪酶的酶学性质进行了初步研究。结果表明:扩展青霉
I
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脂肪酶的最适温度为 35℃,最适pH为 ,在 pH - 范围内该脂肪酶均较稳
2+ 2+
定;最适底物为 C8,对中链酯(C8-C12)有较强的水解能力;Ca 和 Mg 对其有
激活作用,Fe2+,Zn2+,Cu2+ 则有抑制作用,EDTA能使之快速失活。
关键词:扩展青霉脂肪酶基因克隆密码子优化表达
II
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Abstract
As an important industrial enzyme, lipase is widespread in nature. Many lipase genes
have been cloned, and developed into highly effective expressed engineering strains.
Penicillium expansum lipase (PEL), an alkaline lipase, showing a preference for
triacylglycerols, has been widely used in industrialization. In this study,
40356 lipase gene based DNA sequence and cDNA sequence was cloned by PCR
and RT-PCR, respectively. And then, codons used in lower frequencies in Pichia pastoris
were optimized to achieve high expression level. Based on these, the pro