文档介绍：安徽农业大学
硕士学位论文
粉拟青霉蛋白酶分离纯化、基因克隆及液体发酵条件研究
姓名:汪章勋
申请学位级别:硕士
专业:微生物学
指导教师:黄勃;樊美珍
20050601
摘要其毽疆突的鏊拣其酶添力离,,离心,将洗挣豹萤丝体鹊接种至碇A朔捕〕勺糜盏寂嘌校跏蓥龄,蜷菸鏊不露维分聚魄款正交试验,结暴表鹾:羧毅青霉赣撩戆簸逶壤莠本文较系统逡研究了粉羧青霉瞞不溺菌株静垒物学特性和类枯革杆菌蛋白酶酶活;筛选出疑优良生物学蚀状的类枯草杆菌蛋白酶离产菌株;确定了商产菌株最佳发酵培养条件;并对其产髯悦附辛吮芤徊椒掷搿⒋炕嚣怼逸交浚整该蓥臻麴类旗摹耪蘩爨鑫酶薹霞;麸瑟炎改造溅塞瘾孤奏蓑葵定了薹通过预备实验和参考各种文献资料,以下述培养条件诱导鞍酌傅牟合将粉拟青攥菌株接耪谯嘌肷希竦磁嘌]鏊可そ咏值为,。竦磁啾。通过对来自不同地域和寄主的株粉拟青霉进行了类枯草杆菌骚自酶盍Φ牟舛ǎ峁砻鱌与赫株相比选取产鞍酌富盍ο喽越霞虻攴勰馇嗝咕晡J笛椴牧希冉狭怂的生物学特性,分析了它们在产孢嫩、生长速度、抗旱能力、抗紫外能力等方面的差冥。结累淡碉,粉揆卷襟蘧落生长秘产生孢予黪蠼逶漫度为℃。在恕漫震下,孢子萌发率在%~ブ牛淮送獠煌昃部沽懔Σ钜旖洗螅琍购的芰ψ钋浚而箍购的芰ψ钊酢>贤庀哒丈胫甑拿确⒙试タ%范围内。的生长速度,产孢爨,萌发率和抗紫外线能力均为最高或次离。逶这辩供试蓥豫产蛋白酶及生勃学特性方瑟懿醣究笼较,最终确定了菌株作为筛选耀佳发酵培养条件,进一步分离、纯忧鞍酌敢约翱寺∑淅嗫蒈旮司白酶基因的研究对象。不两按秘量抖綪藏栋产嘧悦竿噶τ坝及臼匝榉旒辣碚椋航玉蜢啾4笮对麓株产懊孛副O喽院τ暗詹淮螅喽岳唇サ慕又朱喽圆鶳蛋白酶璺为有利。根据对菌株鞍酌覆盖叩难芯康弥#核淙慌┯盏己幸桓霾父叻澹时又出现另一产酶离峰,根据各种参考文献综含报道,一簸虫奎嶷蘩在鸯羹入诱浮凌镬嗔瞬短濉T谄髀错胺⒔吞躐蛄拙抗中,采用诱导蟮姆⒔鸵鹤魑O臼嫉拇置敢海舛ㄆ涿腹唷在相同培养条件下,以酶的相对活力为指标,通过单因索诱导物、温度、值、条件为:添加ケ嫱膳位狙闻嘌簟⑴嘌露、和接种菌龄。在蛋囱酶纯化过程中,首先向粮酶液中添加硫酸铵粉末分别至不同饱和度,试验结果表明:在%硫酸铵饱和度时,;嚣焉逸箨%豹藏黢铵瓷帮疫菇试验标准。础。
交换层凝,收集酶潺漳,嚣经粉拟青霉菌株的培养液,经盐析、脱盐、褥粗酶样,再经过胱分子箩摹基藐,羧鬃薅活峰。经扌的步骤纯化聪,比活由岣咧岽苛丁;厥章.%。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,经两次柱层析厥的酶样有两条带,未达到电泳纯。根握幸训蔷圩鹊瞎百涿埂G蛱涸外斡┗鸸暧杪探┺⒌睦嗥烨嫫麓蛋自酶基因痔列的同源憾比较,以它们高度保守的核苷酸序列设计~对弓兀塾和相结台的方法,首次从粉拟谢霉中克隆出兜整的茏悦:淙蛄形3墒斓瘫豹氨墓酸澎裂襄金鼋予缭疆蓥,㈡咣扑嗝乖紾醓,金龟予绿僵菌蚱蜢嶷种及的同源性分别为%、%、%和%。成熟蛋融具有典型的丝氨黢蛋蠡酶活毽继点。关键词:粉拟街霉,类枯草杆菌蛋白酶,发酵,分离纯化,基因基因
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文蘸综述叭じ攀化学农药的长期大墩使用,给生态环境造成了巨大破坏,崴接或间接地威胁到人类生存与社会发展。同时,昆虫抗药性的产生,搜他学农药的杀虫效果下降,不能有效遣葑续控麓害虫发垒。霞丽无公害农药静研稍鞠嚣发越来越激到各莺政黪釉企监豹重视。昆呶瘸原真菌魁有效防治害瞰的主要微生物杀虫剂之一,不但具有其它生物杀虫荆的优点,还具有其自身特点如:可以侵染刺吸炎害虫等,因而被越来越广泛地应矮予农鼗秘拣监害虫懿淤浍。霆弱其它徽生蘩杀受裁~撵,杀焱褰蓥蹇存程麓毒毽强长、毒力遇化等限制大瓶模生产使用的难题。研究和解决上述浓题从而更好地利用昆虫病原真荫进行害