文档介绍：食品安全国家标准
体外哺乳类细胞(HGPRT)基因突变试验
(征求意见稿)
xxxx-xx-xx实施
xxxx-xx-xx发布
中华人民共和国卫生部发布
中华人民共和国卫生部发布
2010-06-01实施
2010-××-××发布
前言
本标准代替GB -2003《体外哺乳类细胞(V79/HGPRT)基因突变试验》。
本标准与GB -2003 相比,主要变化如下:
──增加“突变频率”的术语和定义;
──对“试验原理”的内容进行补充,使其更加具体清晰;
──在“试验方法”中,对各种不同种类受试物的配制方法进行描述;增加参考阳性对照物“3-甲基胆蒽,n-亚硝基二甲胺,7,12-二甲基苯并[a]蒽,乙基亚硝基脲”,并根据是否使用代谢活化系统将阳性对照物进行分类;
──增加实验用细胞株“中国仓鼠卵巢细胞株(CHO),小鼠淋巴瘤细胞株(L5178Y),人类淋巴母细胞株(TK6)”。
食品安全国家标准
体外哺乳类细胞(HGPRT)基因突变试验
范围
本标准规定了体外哺乳类细胞基因突变试验的基本原则、要求和方法。
本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素的致突变作用和对人体可能产生的危害,检验对象包括食品原料、食品添加剂(含营养强化剂)、食品新资源及其成份、新资源食品、辐照食品、转基因食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等。
术语和定义
突变频率
所观察到的突变细胞数与存活细胞数之比值。
原理
细胞在正常培养条件下,能够产生次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT),在含有6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine,6-TG)的选择性培养液中,HGPRT催化产生核苷-5’-单磷酸(NMP),NMP掺入DNA中使细胞致死。在致癌和/或致突变物作用下,某些细胞X染色体上控制HGPRT的结构基因发生突变,不能再产生HGPRT,从而使突变细胞对6-TG具有抗性作用,能够在含有6-TG的选择性培养液中存活生长。
在加入和不加入代谢活化系统的条件下,使细胞暴露于受试物一定时间,然后将细胞再传代培养,在含有6-TG的选择性培养液中,突变细胞可以继续分裂并形成集落。基于突变集落数,计算突变频率以评价受试物的致突变性。
仪器和试剂
细胞
常用中国仓鼠肺细胞株(V-79)和中国仓鼠卵巢细胞株(CHO),其他如小鼠淋巴瘤细胞株(L5178Y)和人类淋巴母细胞株(TK6)等亦可。细胞在使用前应进行有无支原体污染的检查。
培养液
应根据实验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养基。对于V79或CHO细胞,常用MEM(Eagle)、DMEM培养液加入10%胎牛血清和适量抗菌素。对于TK6和L5178Y细胞,常用RPMI 1640培养液,加入10%胎牛血清或10%马血清和适量抗菌素(青霉素,链霉素)。
胰蛋白酶/EDTA溶液
用无钙、镁PBS配制,%,%,胰蛋白酶与EDTA溶液按1∶1混合。-20 ℃储存。
活化系统
通常使用的是S9混合物。S9是从经酶诱导剂(Aroclor 1254或苯巴比妥钠和β-萘黄酮联合使用)处理的啮齿动物肝脏获得的。S9的制备同Ames试验。S9的使用浓度为1%~10%(终浓度)。
选择剂
6-硫代鸟嘌呤(6-TG),建议使用终浓度为5 μg/mL~10 μg/mL,%碳酸氢钠溶液配制。
预处理培养液(THMG/THG)
为减少细胞的自发突变率,在试验前,先将细胞加在含THMG的培养液中培养24 h,杀灭自发的突变细胞,然后再将细胞接种于THG(不含氨甲喋呤的THMG培养液)中培养1 d~3 d至细胞恢复正常生长周期和形态。
THMG 所含各物质终浓度如下(除培养液成份外):
──胸苷 5×10-6 mol/L
──次黄嘌呤 5×10-5 mol/L
──氨甲喋呤 4×10-7 mol/L
──甘氨酸 1×10-4 mol/L
试验方法
受试物
受试物的配制
受试物应在使用前新鲜配制,否则就必须证实贮存不影响其稳定性。样品为粉末、颗粒、膏状、片剂等受试物,需溶解于溶剂中,用前稀释至适合浓度。样品为口服液等液体受试物,直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。样品为胶囊,去除外胶囊后,若内容物为粉末,需溶解于溶剂中,用前稀释至适合浓度;若内容物为液体或油状物,选择合适溶剂,用前稀释至适合浓度。样品为固态混合物,加入溶剂浸泡溶解(出),取浸泡液60 ℃旋转蒸发浓缩至试验所需浓度。样