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·论著·
探究中性粒细胞胞外诱捕网加重特发性膜性肾病
内皮功能紊乱并促进高凝状态形成*
禹程远1,陈晓静2,王姣姣3,解汝娟3
,广东深圳,518020;,陕西西安710000;
,黑龙江哈尔滨150000
摘要目的:探究中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)在加重特发性膜性肾病(IMN)内皮功能紊乱并促进高凝形成、
疾病进展中的作用。方法:根据KDIGO指南诊断标准,筛选年龄在18~80岁之间且于2019年3月—2020年12月在哈尔滨医
科大学附属第一医院肾内科行肾活检病理诊断为IMN,病理分期为II、III期的患者,行双下肢彩超或双肾血管彩超,根据
彩超对于急慢性血栓的诊断标准排除陈旧血栓影响,分为有血栓组、无血栓组各20例为IMN组,再选取健康者20例为对照
组。采集实验对象空腹外周静脉血,分离血浆测定各组血浆中细胞外DNA(cellfree-DNA,cf-DNA)、骨髓过氧化物酶
(MPO)-DNA复合物、甲肾上腺素(NE)的含量。用IMN组患者及对照组血浆刺激正常中性粒细胞进行NETs生成实验,
通过免疫荧光显微镜观察NETs结构,并进行NETs提取,进一步进行内皮刺激实验,采用人脐静脉内皮细胞(HUVECs),
观察内皮结构以及促凝表型转变。进行DNA酶(DNase)及抗组织因子抑制实验,观察NETs的生成与凝血间的关系。
结果:与对照组相比,IMN组外周血NETs相关指标明显上升,有血栓组较无血栓组上升更明显。IMN组较对照组血浆更易
刺激中性粒细胞生成NETs,有血栓组较无血栓组生成NETs更明显。与对照组相比,IMN组表现为凝血时间明显缩短,凝
血酶-抗凝血酶复合体(TAT)明显增加,有血栓组较无血栓组更明显,对有血栓组进行抑制试验,发现anti-TF、DNaseI
能明显逆转这一现象。当内皮受到NETs刺激后,内皮间正常连接消失,间隙增大,同时内皮表达TF明显升高,表现为促
凝表型。结论:NETs加剧内皮功能紊乱并驱动血栓倾向。针对NETs形成的策略可能为IMN提供一种潜在的治疗方法。
关键词特发性膜性肾病;凝血;中性粒细胞胞外诱捕网;内皮细胞
.1004-
TheExplorationofNeutrophilExtracellularTrapsinAggravatingEndothelialDysfunctionandPromotingHyperco
agulabilityinIdiopathicMembranousNephropathy/YUCheng-yuan,CHENXiao-jing,WANGJiao-jiao,etal.//Depart
mentofGeriatric,ShenzhenPeople’sHospital,Shenzhen,Guangdong,518020,China
AbstractObjective:Toexploretheroleofneutrophilextracellulartraps(NETs)inaggravatingendothelialdysfunctionand
promotinghypercoagulabilityanddiseaseprogressioninidiopathicmembranousnephropathy(IMN).Methods:Accordingtothedi-
agnosticcriteriaoftheKDIGOguideline,patientsbetweentheagesof18and80whounderwentrenalbiopsyinthehospitalfrom
March2019toDecember2020withapathologicaldiagnosisofIMNandthepathologicalstageofstageIIandIIIwerescreened
Dopplerultrasoundforacuteandchronicthrombus,theinfluenceofoldthrombuswasexcluded,andthepatientsweredividedinto
thethrombosisgroupandthenon-thromboticgroup,20casesineachgroupweretheIMNgroup,and20caseswereselectedas
,andtheplasmawas
separatedtodeterminethecontentsofextracellularDNA(cf-DNA),MPO--
malneutrophilswerestimulatedwithplasmafromtheIMNgroupandthecontrolgrouptoconductNETsgenerationexperiments.
ThestructureofNETswasobservedbyimmunofluorescencemicroscope,andNETswereextracted,andfurtherendothelialstimula-
(HUVECs)wereusedtoobserveendothelialstructureand
-tissuefactorinhibitionexperimentswereperformedtoobservetherelationship
:Comparedwiththecontrolgroup,therelatedindexesofperipheralblood
NETsintheIMNgroupincreasedsignificantly,andtheincreaseinthethrombosisgroupwasmoreobviousthanthatinthe
non-
*基金项目:深圳市医学重点学科建设经费资助项目();深圳市三名工程项目();黑龙江省自然科学优秀
青年项目(YQ2019H019)。
通信作者:解汝娟,E-mail:******@。
黑龙江医学第46卷2022年第7期
group,andthegenerationofNETswasmoreobviousinthethrombosisgroupthaninthenon-
controlgroup,thecoagulationtime(CT)wassignificantlyshortenedintheIMNgroup,andthethrombin-antithrombincomplex
(TAT)wassignificantlyincreased,
wasperformedonthethrombosisgroup,anditwasfoundthatanti-TFandDNaseIcouldobviouslyreversethisphenomenon.
WhentheendotheliumwasstimulatedbyNETs,thenormalconnectionbetweentheendotheliumdisappeared,thegapincreased,
andtheexpressionofTFintheendotheliumwassignificantlyincreased,:NETsex-
-
ticapproachforIMN.
KeywordsIdiopathicmembranousnephropathy;Coagulation;Neutrophilextracellulartraps;Endothelialcells
特发性膜性肾病(IMN)是临床上常见的肾小球滤过断为IMN,且病理分期为II、III期的患者,行双下肢彩超
屏障损伤的疾病,是***肾病综合征(NS)最为常见的病或双肾血管彩超,根据彩超对于急慢性血栓的诊断标准排
因,其血栓栓塞并发症高达7%~50%[1]。疾病的发展与静除陈旧血栓影响,分为有血栓组、无血栓组各20例为IMN
脉血栓栓塞事件发生的风险相关[2]。目前IMN的血栓发生组,再选取健康者20例为对照组。所有人员均对此项研究
机制主要包括凝血功能增强(因子V、VIII,纤维蛋白生知情且同意。排除标准:年龄<18岁或>80岁,合并其他
成增加,血小板聚集等)、抗凝作用减弱(抗凝血酶III、已知肾脏疾病(如糖尿病肾病、IgA肾病等)、恶性高血
蛋白C的丢失)[3],微粒表达增加等[4]。但是,常规的抗血压、糖尿病患者,尿路感染,尿路结石,免疫相关性疾
栓治疗后仍会有心血管事件的发生,且对于治疗时机的选病、恶性肿瘤病史,铁、叶酸和维生素B12缺乏,近一个
择仍存在争议[5],因此,进一步了解IMN血栓形成机制尤月内抗凝剂、溶栓治疗、肾毒性药物与非甾体抗炎药。
为重要。临床中约有70%
受体(PLA2R)抗体阳性,该抗体已成为IMN诊断治疗的RPMI1640细胞培养基、DMEM细胞培养基、胰酶细
一项指标[6],但血清抗体水平并不能及时准确反映疾病进胞消化液、胎牛血清(美国Gibico)。人脐静脉内皮细胞
展,且与肾组织中抗体表达不一致[7],因此寻找新的指标ScienCell(CA,USA)。PMA、DNaseI、中性粒细胞分离
对于监测疾病进展尤为重要。近年来,在多种免疫相关性液、红细胞裂解液(Sigma-Aldrich)。PBS缓冲液(Solar-
血栓疾病中发现中性粒细胞在各种氧化应激环境中可生成bio);中性粒细胞髓过氧化物酶试剂盒(Boster)。中性粒
一种网状结构,称为中性粒细胞胞外诱捕网(NETs),由细胞弹性蛋白酶试剂盒、TAT复合体检测试剂盒(Blue-
DNA、组蛋白及颗粒蛋白等部分组成,具有抗炎、促凝等Gene)。Quant-iTPicoGreends-DNA试剂盒(Invitro-
功能,其网状结构能够捕获血小板、红细胞和纤维蛋白等gen)。VE-cadherin、Anti-TF、CD31、anti-humanMPO、
促凝物质,亦能够与循环中微粒结合为复合体,激发凝血anti-humanNE(abcam)。DAPI(Hoechst)。
瀑布反应,其中组蛋白也能促进内皮细胞表达促凝表型,
8-92方法
最终导致血栓形成[]。研究表面IMN患者外周血中性粒
细胞被大量激活[10-11],且在发病后有活性氧簇(ROS)
统的激活,而后者是NETs形成过程中重要机制[12],基于所有研究对象于治疗前,禁食8~12h后留取肘静脉血
以上观点,研究者提出IMN患者体内存在NETs高表达,5mL,%的柠檬酸钠,并缓慢摇匀。在
可将其可作为一种新的监测指标反映肾脏损伤情况以及评采集30min内,将样品在室温下离心(200×g,10min)
估血栓前状态。正常肾脏存在三层滤过屏障,肾脏有孔内得到富血小板血浆,再次离心(2500×g,2次,每次15min)
皮细胞、基底膜以及上皮细胞,内皮表面存在糖萼、硫酸得到乏血小板血浆,将其储存在-80℃。
软骨素及透明质酸等成分使得有孔肾脏内皮连接紧密,
白无法漏出,当内皮受刺激后,糖萼成份被破坏,硫酸软采用Percoll梯度密度离心法收集血液中的中性粒细
骨素及透明质酸被降解,内皮间隙增宽,大分子蛋白才得胞,并通过赖特-吉姆萨和台盼蓝染色检测这些细胞的活
以漏出,随着基底膜、足细胞的进一步破坏,出现蛋白尿[13]。性和纯度,其结果不低于98%。中性粒细胞(1×106)接种
研究者考虑内皮损伤是IMN疾病进展的关键一步。正常内于聚L-赖氨酸修饰的24孔板中,37℃孵育30min,然后
皮对维持正常血流过程及出凝血平衡,因此IMN多部位血用IMN有血栓组、无血栓组或对照组的血浆对中性粒细胞
栓事件的发生与内皮损伤密不可分。本研究拟探究NETs进行处理,并在37℃、5%CO2孵箱中培养4h,用RPMI
在加重IMN内皮功能紊乱并促进高凝形成、疾病进展中的洗涤细胞,每孔加入RPMI2mL。然后大力摇动样品,将
作用,为IMN的诊治提供新思路。上清液以20×g的速度离心5min后收集上清液中的网状
物,并储存在-20℃冰箱中备用。
1材料与方法
,使用免疫荧光显微镜
筛选年龄在18~80岁之间且于2019年3月—2020年12观察其结构。首先将中性粒细胞接种到聚L-赖氨酸修饰的
月在哈尔滨医科大学附属第一医院肾内科行肾活检病理诊24孔板中,用显微镜观察细胞基本贴壁后,用磷酸盐缓冲
黑龙江医学第46卷2022年第7期
(PBS)溶液对多聚赖氨酸氨酸爬片清洗三次,每次3~5min。APTT、Fibrinogen、D-dimer等与对照组比较,差异有统计
中性粒细胞在有或无刺激的情况下,加入4%多聚甲醛固学意义(P<,,,),但有血栓组与
定(10~15min),PBS清洗1~2次。每孔加入100μLBSA无血栓组间对比无明显差异,见表1。
溶液封闭30min,吸掉封闭液,紧接着加入1∶100的弹性
表1IMN患者和对照组受试者的基本特征
蛋白酶抗体(2%BSA配置),湿毛巾包裹后4℃过夜。吸
IMNⅡⅢ
走一抗,并进行PBS清洗,加入MPO-DNA抗体,室温下孵育(、期)
项目对照组
30min,PBS清洗后在避光环境下每孔加入100μLDAPI(n=20)有血栓组无血栓组
溶液,通透5min后PBS清洗1~2次,加入二抗后,所有(n=20)(n=20)
操作需避光,在避光环境下抠片,将防淬灭甘油滴在载玻年龄(岁)±±±
片上,然后封片剂封片。免疫荧光显微镜对其进行荧光定性别(例,%)12(60)14(70)12(60)
量分析,观察计算中心粒细胞释放NETs占同视野全部细蛋白尿(g/24h)±±
胞的百分比,并进行三次重复试验。白蛋白(g/L)±±±
(mmol/L)±±±
[14-15]
如先前概述方法进行凝时间及TAT测定。血肌酐(mmol/L)±±±
eGFR(mL/min·)±±±
(1)内皮细胞培养:内皮细胞的复苏传代,显微镜下
观察内皮培养基情况,细胞生长至均匀的平铺一层,进行总胆固醇(mmol/L)±±±
dd
下一步实验操作。用镊子将普通细胞爬片置于24孔板中,甘油三酯(mmol/L)±±±
PBS进行冲洗(2~3次),每次5min,清洗后备用。弃掉C3(g/L)±±±
内皮培养基中的培养液,清洗2次,加入1~2mL胰酶消C4(g/L)±±±
化,轻轻拍打瓶身,并实时在镜下进行观察,致大量细胞白细胞(×109/L)±±±
形态变为椭圆状悬浮于培养液后,加入2mL培养液终止中性粒细胞(%)±±±
胰酶消化。吸取液体离心(800×g,3~4min),弃上清,cb
单核细胞(%)±±±
于离心管中加入3~5mL培养液,吸管吹打,用枪头吸10μL
淋巴细胞(%)±±±
左右液体,进行细胞计数板计数,将ECs稀释到细胞浓度
6红细胞(×1012/L)±±±
为10/mL,将稀释后的细胞均匀的移入24孔板。当细胞生
ca
长覆盖70%~80%,将之前提取出的NETs作为刺激物,刺血小板(×109/L)±±±
激铺板后的内皮细胞24h。(2)内皮细胞免疫荧光步骤:PT(s)±±±
细胞爬片进行刺激处理后,PBS冲洗3次,多聚甲醛固定APTT(s)±±±
30min,再次冲洗之后加入BSA封闭30min,用VE-cad-纤维蛋白原(g/L)±±±
herin、TF、CD31的抗体对HUVEC进行染色。将样本与D-dime(rmg/L)±±±
AlexaFluor647、488或555结合的二抗孵育,最后加入ND,未确定;eGFR:估算肾小球滤过率;C3:补体3;
DAPI30min后防淬灭甘油封片,免疫荧光显微镜观察ECsC4:补体4;PT:凝血酶原时间;APTT:活化部分凝血酶原时
的形态变化。用流式细胞术对CD31、VE-cadherin进行检间;与对照组比较a表示P<,b表示P<,c表示P<
测,结果用平均荧光强度表达,重复4次实验。,d表示P<。
cfDNA、MPO-DNA复合体、
NETs的替代指标[16]。将采集好的血浆和试剂盒恢复至室与对照组相比,IMN伴有血栓和不伴有血栓患者外周
温,根据制造商说明,使用Quant-itPicoGreendsDNA试血MPO-DNA复合物、cell-freeDNA、NE水平均明显升高
剂盒定量测定IMN患者血浆样本中的cf-DNA水平。ELISA差异有统计学意义(P<),有血栓组较无血栓组水平
用于定量血浆MPO-DNA复合物,如之前的描述[17]。根据提明显升高,差异有统计学意义(P<),见图1。
供的说明,还使用特异的ELISA试剂盒检测NE。
波长下读取OD值,进行MPO-DNA复合物及NE浓度计算。IMN患者组可见明显的丝状结构,并用免疫荧光观察
、MPO、NE,发现MPO、NE均黏附在DNA链上,其
。计量资料以均数±含量较对照组明显增加,同时对能够产生NETs的中性粒
标准差(x±s)表示,组间比较采用t检验。以P<,IMN组患者与对照组比较,差异无
差异有统计学意义。统计学意义(P<),有血栓组与无血栓组比较,差异
有统计学意义(P<),见图2。
3结果
,IMN组患者CT明显缩短,有血栓组
IMN组患者血浆白蛋白、血脂、中性粒细胞、PLT、比无血栓组时间缩短更明显。用anti-TF、DNase可有效抑
黑龙江医学第46卷2022年第7期
对照组无血栓组有血栓组对照组无血栓组有血栓组对照组无血栓组有血栓组
与对照组比较**P<,与无栓组比较#P<。
图1IMN患者和对照组循环血液中的NETs相关指标
组
照
)
对
%
(
胞
细
组
粒
栓
性
血
无
中
s
T
E
N
组
放
栓
释
血
有对照组无血栓组有血栓组
与对照组比较a表示P<,与无栓组比较b表示P<。
图2IMN血浆更有可能促进中性粒细胞的细胞外陷阱。(免疫荧光×400)
较无血栓组更明显,用anti-TF、DNase可减少TAT复合物
生成,见图3。
NETs刺激组ECs皱缩,细胞间距离增大,CD31的表
达降低,TF表达增加,使得内皮细胞向促凝活性转变,且
VE-cadherin的表达降低,细胞边缘显著延长。流式细胞
仪对CD31、VE-cadherin表达定量分析,显示二者菌显著
对照组无血有血对照组AntiDNASE降低,见图4。
栓组栓组-TFI
4讨论
本文通过对IMN高凝状态的探究,提出了NETs可作
为免疫与血栓联系的桥梁,可作为一种新的监测指标,反
映疾病进展程度。研究者得出以下结果:(1)IMN患者血
浆更容易促使中性粒细胞表达NETs,且随着凝血的加
重,NETs升高更明显,也说明NETs能更敏感地反映高凝
对照组无血有血对照组AntiDNASE状态的形成。(2)NETs可明显缩短CT,促进凝血酶的生
-TF
栓组栓组I成,而抗组织因子抗体和DNaseI可减弱NETs促凝作用。
与对照组比较a表示P<、b表示P<,与无栓组比较c表
(3)NETs高表达可损伤内皮细胞,使得内皮结构改变,
示P<,与有栓组比较d表示P<、e表示P<,与抗TF组
同时向促凝表型转化。NETs不仅可作为疾病早期血栓并发
比较f表示P<。
图3NETs促进了IMN患者的促凝血活性症程度的监测指标,同时也能为抗血栓治疗提供新的方向。
之前对于IMN血栓相关性的研究认为,其与血小板活
[17]
制NETs导致的促凝影响,且DNaseI作用更强。而IMN组化、凝血因子启动、抗凝物质减少、纤溶抵抗等因素
[18]
患者较对照组患者凝血酶-抗凝血酶水平更高,有血栓组有关,近些年又有人提出微粒促进高凝状态形成,现有
黑龙江医学第46卷2022年第7期
与对照组比较a表示P<。
图4NETs损害内皮细胞并促进其促凝表型(免疫荧光×400)
抗栓治疗并不能很好地解决血栓并发症的发生,目前临床PLA2R抗体是否能与中性粒细胞反应,发生类似凋亡作
上主要以血浆白蛋白水平作为预防性抗凝治疗指标,但治用,目前仍未被证实,这也许是IMN患者外周血中NETs
疗效果不佳,因此对于治疗时机的选择仍存在争议。这就生成增加的重要原因。本文主要证明了IMN患者中存在
需要我们进一步探究IMN患者血栓发生机制,寻找新的监NETs的高表达,但并没有对其生成机制进一步探究,最
测指标。IMN患者是一种免疫相关的肾脏疾病,随着免疫近的报道证明,
系统的激活,多种炎症因子、炎症介质高表达,促进凝血氧化应激反应,进一步促进NETs生成,NETs的生成促进
系统的激活[19],但目前主要聚焦于T、B细胞的研究,固PLA2R抗体表达[12]。因此对于抗体与NETs出现的先后顺
有免疫细胞参与疾病的过程涉及相对较少,越来越多的研序仍具有争议,这也是本次研究我们未将抗体与中性粒细
究发现IL-17A在肾脏损伤中发挥重要作用,与其伴随的胞进行分析的原因,我们需要进一步探究,后期需通过构
中性粒细胞的聚集有关[20]。有Th17介导的炎症的MN患者建动物模型进行研究,目前血浆抗体水平变化与蛋白尿变
有更多的静脉血栓事件的发生,利妥昔单抗治疗可诱导化,疾病缓解并不一致[23],如果能够将抗体与NETs的相
Th1和调节性T细胞细胞因子,但并不能有效抑制Th17细互关系了解清楚,那么对于IMN的治疗将会有很大意义。
胞,伴有IL-17升高的MN患者预后较差。IL-17与中性粒肾脏内皮细胞作为三层滤过屏障之一,在蛋白尿的形
细胞作用密切相关,如果对中性粒细胞参与IMN患者发病成中发挥重要作用。生理情况下,其存在电荷屏障和分子
机制进行相关性研究,抗体合并相应抑制剂治疗是否能改屏障,在IMN中,先是电荷屏障破坏,一些小分子蛋白能
善预后[21]。因此研究者将中性粒细胞作为主要研究对象。够滤过,随着疾病的加重,内皮结构改变,间隙增宽,会
而内皮作为第一道屏障,在凝血-抗凝平衡的维持,血栓导致大分子蛋白也滤过,虽然对于滤过屏障的研究,大多
的发生过程起到重要作用,因此研究者认为内皮在IMN患数人认为足细胞骨架发挥重要作用,但不可否认,内皮作
者血栓的发生中也起着重要作用。本文主要探究了中性粒为第一道屏障,只有当其破坏越严重,才能出现越来越多
细胞与内皮细胞的相互作用对IMN患者高凝状态形成的影响。的蛋白向足细胞屏障滤过。同时内皮也是凝血-抗凝系统
NETs在心脑血管、肾脏相关等疾病[22]中已有不少报平衡的重要调节物质,而IMN患者中NETs的高表达导致
道,从开始的抗炎研究,到后期的促炎、促凝的研究,对内皮损伤,因此呈现出大量蛋白尿以及高凝的表现。而
于NETs的了解越来越深入。在IMN中对于NETs的研究目DNaseI、抗组织因子抗体的抑制能够减轻NETs损伤,这
前仍较少,2002年有相关研究报导游离的磷脂酶A2(sP-也许能够作为一种新的治疗手段。内皮表面表达CD31,
LA2-IB)与中性粒细胞表面相关受体—PLA2R1结合,使VE-cadherin是细胞间重要的连接分子,我们的体外细胞
得p38MAPK信号激活,进而刺激了NE释放和细胞粘附,研究发现,当NETs刺激内皮细胞后,CD31、VE-cadherin
同时sPLA2与受体结合,激活下游分子后具有促凋亡作用。在水平均降低,同时内皮发生皱缩、间隙增大等结构改变,
多种疾病研究中发现中性粒细胞存在一种新的死亡方式,证明了NETs通过对内皮结构的破坏影响其功能。
称之为NETosis,其在炎症和血栓中发挥重要作用。IMN之前对于IMN患者高凝机制的研究多以肾病综合征病
患