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桑叶生物碱抑制糖尿病肾病大鼠肾问质纤维化的研究·实验研究·术素咿红—琀染色法染色,观察各组大鼠肾组织病理改变;染色观察各组吴锋韦丽宝鸡市人民医院内分泌科,宝鸡通信作者:韦丽,簑.『窖埂ū谖淋郑旦箜鲞箜堋豢盥业,垒塑型;瑈;【摘要】研究桑叶生物碱能否抑制糖尿病肾病珼大鼠肾问质纤维化。方法只笫蟛捎酶咧尾静脉注射链脲佐菌素琒椒ń笫竽P停ń3晒Φ拇笫笥盟婊直矸治DP妥椤⒈茨瞧绽椤⑸R渡锛畹停緁/高剂量组,每组只。只笫笸庇枰员曜家尾静脉注射等体积枸橼酸钠缓冲液,记为对照组。贝那普利组予以痥茨瞧绽辔福R渡锛畹汀⒔怼⒏呒亮孔榉直鹩枰、痥桑叶生物碱灌胃,模型组和对照组均予以#痥硌嗡辔福刻次,共给药周。全自动生化分析仪检测尿微量白蛋白琺、血肌酐,、血尿素氮,并计算内生肌酐清除率,;使用苏肾组织胶原纤维沉积并计算肾间质纤维化相对面积;实时逆转录荧光定量聚合酶链反应检测各组肾组织转化生氏因子一口穚琓—、⒔岬拮橹ひ蜃,⑾宋拥鞍現、信使核糖核酸琺表达;蛋白质印迹法检测各组肾组织狟、鞍妆泶锛閙水平。结果模型组肾小球体积增大、系膜基质增生、基底膜增厚,肾小管上皮细胞空泡样变,肾问质有大量炎症细胞浸润,染色观察可见大量蓝灰色胶原纤维沉积;桑叶生物碱亮孔楹捅茨瞧绽檠9苌鲎橹”浼跋宋榭鼍胁煌潭雀纳疲挥攵哉兆楸龋P妥椤⑸R生物碱亮孔楹捅茨瞧绽閙、蜕鑫手氏宋喽悦婊一、、和蛋白的表达及閙—、⑸鑫手氏宋喽悦婊一、、和蛋白的表达及—浇档停珻升高.=崧桑叶生物碱能够降低、水平,上凋剑行б种艻大鼠肾问质纤维化,减缓终末期肾病进程。【关键词】桑叶生物碱;糖尿病肾病;肾问质纤维化,【】目的,珺’,娃甅—./甀/开放科学试捶标识码、./甶..门叩印。”啊癴孩,蟆癹阂椋椋珸—琤.·.
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诱导靘籗用D壳埃贒闹瘟粕先砸钥刂蒲L恰⒀Q挂鼠模型,探讨桑叶生物碱能否抑制大鼠的肾问质纤维化,并初步探讨其可能作用机制。籌糖尿病肾病珼是糖尿病患者的主要并发症之一,是欧美发达国家终末期肾病的最主要病因,在中国的发病率亦呈逐年上升趋势,目前已成为中国终末期肾病的第二大病因患者的主要组织学损伤特征是胶原蛋白、纤维连接蛋白,认赴饣,合成增加、降解被抑制,并沉积在肾小球系膜和肾小管问质,最终导致不可逆的肾间质纤维化,而肾问质纤维化几乎是所有。肾脏类疾病发展至终末期的主要原因”。转化生长因子一,蝗衔J肾间质纤维化过程中的关键调节因子,可通过春衔镄纬刹⒔胂赴核,促进其下游的结缔组织生长因子,谋泶铮⒆饔糜谄湎赴核内的转录因子激活下游的效应因子,最终导致肾纤维化的发生。作为榈嫉纳鑫质纤维化的下游效应因子,能够调节成纤维细胞的生长及姆置冢谏鱿宋讨衅鹬匾W及调节血脂为主要治疗原则,但其在抗纤维化方面效果并不明显。桑叶生物碱是桑叶的主要活性成分之一,能够有效改善糖尿病所引起的肾脏功能损伤,降低糖尿病小鼠的尿微量白蛋白,浚纳粕鲎橹±肀浠S醒芯表明,桑叶生物碱在防治、减缓终末期肾病进程中有重要意义尽。鉴于此,本研究通过建立大材料与方法一、主要材料与试剂笛槎周龄无特定病原体,清洁级健康坌源笫螅体质量.±.,购自广东省医学实验动物中心,合格证号:一,本研究经宝鸡市人民医院动物实验中心伦理委员会审核批准急嗪牛『阊埂3急谔廛郑钚旦箜丝鲞箜堋豢盟业垒业堕,,塑—琧【痬痟//,猶,琒甌一口琒,珻現猵珻琒,,猵琒,“琺虎鬒.。琾—.,,瑀..琺琒,瑀猄,珺,珻現琣,瑄猺篶琫—籖./....—
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锍ざ饕5囊┪镉胧约;贝那普利本祷V埔┯邢产批号籑旧约梁北京,索鼠标准饲料和高脂饲料眨揭┥锕こ逃邢薰荆盼公司,生产批号;桑叶生物碱靼玻宝生物科技有限公司,生产批号;链脲佐菌素琒德国,荆批号;苏木素一伊红—旧约梁上海,古朵生物科技有限公司,生莱宝科技有限公司,生产批号;兔抗鼠タ寺】固均为美国,荆于比号谎蚩雇肨右、——嗫寺】固C拦瑂公司,生产批号、笛橐瞧腿远化分析仪毡荆琀公司籅型高速冷冻离心机鹿琖公司籆型超低温冰箱鹿珽公司籆—凸庋晕⒕美国,公司籇数码显微图像分析系统虾#炭倒庋б瞧饔邢薰司籷;型德国,—公司籈型电泳仪拦珹公司籌湍撼上穹治鱿低德国,。二、实验方法!⒎肿橛敫┓椒ㄈ籗笫蟾予高脂饲料饲养,自由饮水,记为建模组;另取只大鼠同时予以标准饲料饲养,自由饮水,记为对照组。芎蠼W榇笫蟀/经尾静脉注射欢哉兆榇笫缶簿猜鲎⑸涞忍寤蔫坶谒崮缓冲液。,在两次蔷笥/4鼠中随机处死唬ü鼿旧ü鄄焐鲎橹±砀变,若出现肾小球基底膜增厚、问充质细胞弥漫性增生并有巯窒蠹次=3晒=ń3功大鼠采用随机数字表法分为模型组、贝那普利组、桑叶生物碱低/中/高剂量组,贝那普利组予以/贝那普利灌胃,桑叶生物碱低、中、高剂量组分别予以、/桑叶生物碱灌胃,模型组和对照组均予以./生理盐水灌胃,每天危哺堋远治鲆羌觳鈓⒀<◆,、血尿素氮并计算内生肌酐清除率,给药第堋⒌周和第周的最后一天分别收集各组大鼠蛞海远治仪检测和尿肌酐。在收集尿液后用戊巴比妥分别麻醉各组大鼠,取血,在×胄牧Φ条件下离心取血清。瓵型全自动生化分析仪毡綡术公司觳鈙、计算得出/蚣◆”疞撩糠种尿量#痬疭眒/。瓾旧ü鄄旄髯樯鲎橹±砀谋给药周后,分别将各组大鼠麻醉并取出双肾,于嫣跫下经生理盐水灌洗后取部分肾组织放人%福尔马林中同定,留取肾皮质部分放入液氮保存,放人一姹渲卸炒姹赣谩H「髯榇笫蟛糠稚鲎织用サ募兹┩荻染凭阉笥枚甲苯透明袂衅衅锰荻染凭蜡后苏木精染液染色魉逑魉洗至切片返蓝,伊红染液染色魉慈ヒ梁染液后用梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封存,光学显微镜下观察各组。肾组织病理改变。甅旧ü鄄旄髯樯鲎橹涸宋粱并计算肾间质纤维化相对面积将各组肾脏石蜡切片脱蜡后用梯度酒精脱水,将脱水后的玻片依次经苏木精、酸性丽春红、チ最馑帷⒈桨防度旧ǎ荻酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封存。豆庋显微镜下观察各组肾组织胶原纤维沉积并采集图像。每张选取个不连续的视野,采用数码最微图像分析系统自动分析肾问质纤维化相对面积,计算肾问质蓝染面积占视野面积的百分比取均值。凳蹦孀B加ü舛烤酆厦噶捶从琑觳飧髯樯鲎橹疶甲、攀购颂呛怂琺表达分别取各组大鼠的肾皮质组织,觳飧髂康幕虻谋泶铩R锞杀本┥罾云生物科技有限公司设计合成,其中上游引物掠我,一上游引物掠我物锍ざ;嫌我掠我,『窖埂ū谔廛郑5旦箜鲞箜堋豢堕业,垒塑型;瑈;狫、、、、猄、。,瓵琠一;狦籆狢狦、、、、、
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释比豪,室温孵育过夜。次日取出洗膜,加。白为内参,用啤⒎ḿ扑愀骰蛳喽员泶锪俊,。.为差异有统计学意义。验证的淮笫笸舛哉兆橛只,建模组余建模成功型组只,贝那普利组只,其余各组均唬渲物长度;嫌我,掠我锍ざ;上游引物狦掠我’—产物长度从μ逑倒禝。。鞒蹋鲅贰R詊<《鞍字视〖7各组肾组织猨、、、蛋白表达及水平取冻存的各组大鼠肾皮质组织加入细胞裂解液提取总蛋白。胶槽中加样品和蛋白标准品各”缬痉掷搿=胶转到聚偏***乙烯ど希%牛奶封闭<尤胍豢稀入二抗∈捅任:椅孪路跤螅冲洗危看肚Х⒐液反应凳蚁杂埃訨D诓危成像系统计算各目标蛋白灰度值。三、统计学方法采用料经检验均符合正态分布且方差齐,采用乏±示,以单因素方差分析,采用杉煅槊样本差结一、大鼠的建模及分组情况对照组大鼠两次测血糖均低于肾组织无明昆改变,无明最郏唤W榇笫两次测血糖均高于./鲎橹±砀谋洌出现肾小球基底膜增厚,间充质细胞弥漫性增生并有巯窒螅な礑笫蠼3晒Α=W大鼠和对照组大鼠各处死唤心P脱橹ぃP大鼠只。建模组建模成功大鼠分组情况如下:模模型组在治疗过程中发展至终末期。肾病死亡二、各组大鼠、和冉在同一建模时问,与对照组比,模型组、桑叶生物碱亮孔楹捅茨瞧绽閙和高、档;与模型组比,桑叶生物碱剂量组和贝那普利组、虰降低、。各建模组内大鼠、随建模时问增加而增加,娼J蔽增加而降低,桑叶生物碱亮孔楹捅茨瞧绽榇鼠、随建模时问增加而降低,建模时问增力隽。三、染色观察肾组织病理改变对照组大鼠肾小球形态大小正常,无系膜基质增生、无基底膜增厚,。肾小管无水肿、空泡样变,肾问质无炎症细胞浸润和纤维组织增生;模型组大鼠可见肾小球体积增大明显、系膜基质增生、基底膜增厚,。肾小管上皮细胞空泡样变,。肾问质有大量炎症细胞浸润;桑叶生物碱低剂量组大鼠肾小球体积增大,系膜基质增生,基底膜轻度增生,肾小管上皮细胞部分空泡样变,。肾问质有炎症细胞浸润;贝那普利组和桑叶生物碱中剂量组肾小球轻度肥大,系膜基质轻度增生,基底膜轻微增厚,肾小管轻度水肿,肾问质少量炎症细胞浸润;桑叶生物碱高剂量组大鼠肾小球无明显肥大,系膜基质增生不明显,肾小管无明显水肿,肾问质炎症细胞浸润不明显。四、染色观察大鼠肾组织胶原纤维沉积和肾间质纤维化相对面积的计算对照组大鼠肾组织有极少量蓝灰色胶原纤维沉积,模型组大鼠肾组织有大量蓝灰色胶原纤维沉积,桑叶生物碱亮孔楹捅茨瞧绽樯鲎橹痘色胶原纤维沉积较模型组均有不同程度减少。与对照组比,模型组、桑叶生物碱亮孔楹捅那普利组肾问质纤维化相对面积均升高;与模型组比,桑叶生物碱亮孔楹捅茨瞧利组肾问质纤维化相对面积均降低,桑叶生物碱作用呈剂量依赖性且桑叶生物碱中剂量组与贝那普利组。肾问质纤维化相对面积差异无统计学意义『阊埂3急谖淋郑畹;堡硭况唧塑』垦乱道,垒刀;瑈;果只。ば汀建模成功的大鼠对比对照组大鼠的肾组织染***.。图旧ǎ
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呈虿⑧一~’、、——多∈;:羞『垣压。竖壁瘟苤,叁垫生唧塑』垦橐苄停,换ニ图髯榇笫髆、虲水平的柱状图榇笫蟮膍剑组大鼠的剑组大鼠的剑组大鼠的榇笫笊鲎橹旧染色,×榇笫蟮纳鲎橹涸宋粱榭染色,×注:与对照组比,;与模型组比,‘;与贝那普利组比,‘;与桑叶生物碱低剂量组比,‘;与桑叶生物碱巾剂量组比,;与本组建模鼙龋氡咀榻周比,;为尿微量白蛋白;Q<◆籅为血尿素氮;D生肌酐清除率。图百建模建模周正常组姒那普利组模型组桑叶生物碱低剂晕组桑叶,锛罱砑辆郑虹桑叶牛物碱高剂景纰桑叶生物碱中剂量组桑叶生物碱高剂量组一,一∞。。.三￡寸∽正《妄一≥∞肛海弧肛“
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蓬鱂谳。:篓雾摹型蹇蒌髁擎掣瓣◇;一口】一一—■●’●●觥瘛觥!瘛猒茎毫畂等,其发病过程南多种冈素调控,包括糖脂代谢紊遗传因素等弧D壳癉闹瘟浦饕R钥靥墙笛埂纠正糖脂代谢紊乱为主,但这些治疗方式在抗炎和水平差异无统计学意义。、讨论的危险因素有高血糖、高血压、肥胖、高龄乱、。肾血流动力学改变、多元醇积聚、炎症反应以及抗纤维化方面效果有限,如何有效抗炎症反应并抑制肾脏纤维化,从而阻止和延缓向终末期肾病发展,成为目前亟待解决的难题。监压’垣壁题苤,苎垫生硭况唧塑』垦乱道,垒刀;瑈;各组大鼠肾组织狟、蛋白、的蛋白质印迹冈注:豢为转化生长冈子一;为结缔组织,上长冈子为纤维连接蛋白。图勉强船犍勰撕驰如”加正常组模型组贝那普利组桑叶生物碱低剂量组桑叶生物碱中剂量组桑叶生物碱高剂量组:爿纠≈兰组碱低剂量物碱。亮孔碱高剂量组一摹一再旧苌罂姆女峰曰一虹一猄猘”,
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一一一一一一一一一~一一一一一~一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一~一~一~、本研究中模型组肾小球体积增大明显,系膜基质增生、基底膜增厚、肾小管上皮细胞空泡样变,肾问质有大量炎症细胞浸润,染色观察可见。肾组织有大量蓝灰色胶原纤维沉积;桑叶生物碱量组和贝那普利组血管肾组织及纤维化情况均有不同程度改善,桑叶生物碱作用呈剂量依赖性,说明桑叶生物碱对大鼠肾组织有明显保护作用。大量研究表明颊叩纳鏊匾谎9芙粽潘叵低彻燃活并引起尿蛋白的增加会直接导致肾小球系膜细胞的增生和行栽黾泳奂送饣够嵋鹕问质纤维化,最终发展为终末期肾病⋯。贝那普利是血管紧张素转化酶抑制剂的第三代制剂,主要通过改善肾血流动力学、减少肾小球基底膜增厚和幕劾唇档湍虻鞍缀俊⒀踊篋姆⒄菇程。IR渡锛钍巧R兜奶卣骰钚猿煞郑赏ü改善肾小球基底膜和系膜增生及肾小管损伤变性的情况,减轻大鼠肾脏代偿反应,实现保护肾脏的作用。有研究显示,桑叶生物碱能够有效降低大鼠的。肾脏肥大指数和系膜基质增生情况,显著改善氧化应激导致的肾损伤”⋯。本研究中,与模型组相比,桑叶生物碱亮组和贝那普利组、和肾问质纤维化相对面积降低并且撸R渡锛钭饔贸始量依赖性,说明桑叶生物碱有下调、水平,减少肾间质纤维化相对面积和上调的效果。是糖尿病的常用检测指标,虲均为临床常用的主要肾功能指标,其中芄怀醪脚卸仙鏊鹕顺潭龋珺是判断肾小球滤过功能的常用指标,硎旧鲂∏蚵斯省1那普利一方面可通过抑制血管紧张素转换酶的分泌减少血管紧张素的生成,促使尿蛋白含量下降减轻肾损害;另一方面,贝那普利还可以在一定程度上扩张肾血管、改善血液流动性、提高肾小球滤过率。。桑叶总生物碱能显著下调大鼠含量及剑纳粕鲎橹±硭鹕耍档汀I鑫手纤维化相对面积‘”S醒芯恐赋錾R渡锛钅芟著降低盏嫉腄笫蟮膍剑档水平,有效降低。肾问质纤维化相对面积,改善受损肾脏的功能薄组和贝那普利组猨、、、和蛋白的表达及水平均降低,桑叶生物碱作用呈剂量依赖性,说明桑叶生物碱有下调猨、、、平的效果。猨是已知的写佟I鲂∏蛳宋化最强的细胞因子,能显著促进鞍椎纳桑抑制慕到獠⒓涌臁I鑫手氏宋痟作为猨下游主要效应蛋白,当猣受体被激活时,蚐磷酸化生成的猄和猄可与岷闲纬蓀—籗异聚体进入细胞核,进而调控下游基因┑鹊淖B急泶铮榈忌鲂∏蛳的は赴纳桑钪盏贾律鲈嘧橹宋痮⋯肾纤维化中一种主要的煞郑現铣傻脑黾会促进幕郏俳黾渲氏宋虳进展薄S醒芯肯允荆R渡锛钅芟灾碌鞲的表达,抑制肝脏星状细胞的活化、减少暮铣桑行Ъ跚岣卧嘞宋潭萶⋯8上述资料合理推测桑叶生物碱可能是通过调节粅、、的表达来减轻大鼠肾问质纤维化,但其具体作用通路尚不十分明确,有待进一步的研究。综上所述,桑叶生物碱能降低、水平,上调健S行б种艱笫笊鑫手氏宋化,减缓终末期肾病进程。本研究进一步阐释了桑叶生物碱对肾脏组织的保护作用和机制,为临床治疗┪锏难蟹⑻峁┝耸笛橐谰荨『阊埂3急谔廛郑赖旦箜鲞箜堋豢堕业,垒塑型;瑈;参考文献所有作者均声明没自‘利益冲突利益冲突
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