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二甲双胍激活SIRT1信号抑制内质网应激减轻阿霉素引起的心脏毒性
孔令恒1,高佳琳2,张 景2,徐臣年3,孙 娜1,魏 明1,苏兴利1*(1西安医学院基础部基础医学研究所,西安
710021;2西安医学院临床医学院;3北部战区总医院心外科;*通讯作者,E-mail:******@)
摘要: 目的 探讨二甲双胍(metformin,Met)抑制内质网应激减轻小鼠阿霉素(doxorubicin,Dox)心脏毒性的作用和机制。
方法 采用C57BL/6小鼠腹腔注射阿霉素(15mg/kg)制备心脏毒性模型。60只小鼠随机分为4组(n=15):sham组(腹腔
注射生理盐水)、模型组、低剂量组(50mg/kgMet+Dox)和高剂量组(100mg/kgMet+Dox)。采用左室射血分数(LVEF)和左
室短轴缩短率(LVFS)评价心脏功能,采用HE染色、心脏质量/胫骨长度(HW/TL)和血清乳酸脱氢酶(LDH)含量评价心肌损
伤。TUNEL染色检测心肌细胞凋亡,Westernblot检测凋亡相关蛋白(cleavedCaspase-3和cytochromeC)、内质网应激蛋白激
酶R样内质网激酶(PERK)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和磷酸化真核细胞起始因子2α(p-eIF2α)以及沉默信息调节因子1
(SIRT1)和乙酰化叉头转录因子1(Ac-Foxo1)的表达。 结果 与sham组比较,Dox组LVEF、LVFS和HW/TL比值降低(P<
),心肌纤维肿胀、空泡化,血清LDH含量增加(P<),cleavedCaspase-3和cytochromeC表达以及细胞凋亡率增加
(P<),PERK、p-eIF2α和Ac-Foxo1表达增加(P<),GRP78和SIRT1表达降低(P<);与Dox组比较,低剂量组
LVEF、LVFS和HW/TL比值增加(P<),心肌纤维肿胀、空泡化减少,血清LDH含量降低(P<),cleavedCaspase-3和
cytochromeC表达、细胞凋亡率、PERK、p-eIF2α和Ac-Foxo1表达降低,GRP78和SIRT1表达增加(P<);与Dox组比较,高
剂量组LVEF、LVFS和HW/TL比值增加(P<),心肌纤维肿胀、空泡化减轻,血清LDH含量降低(P<),cleaved
Caspase-3和cytochromeC表达、细胞凋亡率、PERK、p-eIF2α和Ac-Foxo1表达降低,GRP78和SIRT1表达增加(P<)。
结论 Met可以通过激活SIRT1信号抑制内质网应激改善Dox引起的心脏毒性。
关键词: 二甲双胍; 阿霉素; 内质网应激; 心脏毒性
中图分类号: R965 文献标志码: A 文章编号: 1007-6611(2022)10-1261-07 DOI:.1007-
Metforminalleviatesdoxorubicin-inducedcardiotoxicitybyinhibitingendoplasmicreticulumstressviaactivationofSIRT1signaling
pathway
KONGLingheng1,GAOJialin2,ZHANGJing2,XUChennian3,SUNNa1,WEIMing1,SUXingli1*(1InstituteofBasicMedical
Science,Xi’an710021,China;2SchoolofClinicalMedicine,Xi’anMedicalUniversity;3DepartmentofCardiovascularSurgery,General
HospitalofNorthernTheaterCommand;*Correspondingauthor,E-mail:******@)
Abstract: Objective Toinvestigatetheroleanditsunderlyingmechanismsofmetformin(Met)improvingthedoxorubicin-induced
cardiotoxicitybyinhibitingendoplasmicreticulumstress. Methods C57BL/6micewereintraperitoneallyinjectedwithdoxorubicin
(15mg/kg)(n=15):shamgroup(intraperito-
nealinjectionwithsaline),modelgroup,lowdosegroup(50mg/kgMet+Dox)andhighdosegroup(100mg/kgMet+Dox).Left
ventricularejectionfraction(LVEF)andleftventricularfractionshortening(LVFS),
heartweight/tibiallength(HW/TL)andserumlactatedehydrogenase(LDH)contentwereusedtodeterminethemyocardialinjury,
-
teins(cleavedCaspase-3andcytochromeC)andendoplasmicreticulumstressproteins(PERK,GRP78andp-eIF2α),andtheprotein
expressionofSIRT1andAc-Foxo1. Results Comparedwithshamgroup,LVEF,LVFSandHW/TLweresignificantlydecreasedin
Doxgroup(P<),themyocardialfiberwasswollenandvacuolization,serumLDHwasincreased(P<),theproteinlevelsof
cleavedCaspase-3,cytochromeC,PERK,p-eIF2αandAc-Foxo1andtheapoptoticratewereincreased(P<),andtheprotein
levelsofGRP78andSIRT1weredecreased(P<).ComparedwithDoxgroup,thecardiacfunctionandstructurewereimprovedin
lowdosegroup,LVEF,LVFSandHW/TLwereincreased(P<),themyocardialfiberchangeswerealleviated,serumLDHwas
decreased(P<),theproteinlevelsofcleavedCaspase-3,cytochromeC,PERK,p-eIF2αandAc-Foxo1andtheapoptoticrate
weredecreased(P<),andtheproteinlevelsofGRP78andSIRT1wereincreased(P<).ComparedwithDoxgroup,the
cardiacfunctionandstructurewereimprovedinhighdosegroup,LVEF,LVFSandHW/TLwereincreased(P<),themyocardial
基金项目:国家自然科学基金项目(81774415);陕西省教育厅重点科学研究计划项目(20JS135);榆林市科技局产学研项
目(CXY-2020-093);大学生创新创业训练计划项目(121522073)
作者简介:孔令恒,男,1984-12生,博士,副教授,E-mail:******@
收稿日期:2022-05-29
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fiberchangeswerealleviated,serumLDHwasdecreased(P<),theproteinlevelsofcleavedCaspase-3,cytochromeC,PERK,
p-eIF2αandAc-Foxo1andtheapoptoticrateweredecreased(P<),andtheproteinlevelsofGRP78andSIRT1wereincreased
(P<). Conclusion Metformincouldinhibittheendoplasmicreticulumstressandimprovethedoxorubicin-inducedcardiotoxici-
tybyactivatingSIRT1signaling.
Keywords: metformin; doxorubicin; endoplasmicreticulumstress; cardiotoxicity
阿霉素(doxorubicin,Dox) 模型制备和实验分组
肿瘤药物,具有抑制RNA和DNA合成的作用,临床将C57/BL6小鼠随机分为4组(n=15):对照
上常用于治疗多种恶性肿瘤[1,2]。但Dox具有强烈组(sham组)、模型组(Dox组)、50mg/kgMet+Dox
的细胞毒性,尤其是不可忽视的心脏毒性问题,引起组(低剂量组)和100mg/kgMet+Dox组(高剂量
患者严重的心肌病和充血性心力衰竭等不良症组);各组小鼠适应性喂养3d后再按不同分组处理。
状[3,4]。研究表明Dox引起心脏毒性的机制与增加其中,,每
氧化应激、抑制拓扑异构酶2、扰乱线粒体功能、促日灌胃生理盐水一次,连续7d;Dox组一次性腹腔注
进细胞凋亡以及自噬功能障碍等有关,并且具有时射Dox(15mg/kg),每日灌胃生理盐水一次,
间和剂量依赖性与不可逆性的特点[5-7]。近来研究连续7d;低剂量组一次性腹腔注射Dox(15mg/kg)
发现,,每日灌胃50mg/kgMet一次,连续7d;高
演了关键作用[8]。因此,抑制内质网应激成为防治剂量组一次性腹腔注射Dox(15mg/kg),每
Dox心脏毒性的潜在靶点。日灌胃100mg/kgMet一次,连续7d。
二甲双胍(metformin,Met) 超声心动图检测心脏功能
的一种一线口服降糖药,可通过改善患者胰岛素抵2%***将C57/BL6小鼠快速麻醉,用脱毛
抗,促进胰岛素分泌以维持血糖稳定[9]。除了降低膏将麻醉好的小鼠胸前区被毛脱去,将小鼠四肢固
血糖外,Met在抗炎、抗氧化应激和改善线粒体功能定在恒温板的电极上,监测心电变化。然后使用
方面的作用也逐渐被报道,并且Met可不依赖于降Vevo2100超声成像系统进行经胸壁超声心动图检
血糖而在心血管疾病中发挥保护作用[10-12]。已有测。采用M超在心脏短轴乳头肌水平测量并记录
研究发现Met可通过调节自噬减轻Dox诱导的心脏心脏功能。用Vevo软件计算各组心脏左室射血分
毒性[13]。沉默信息调节因子1(silentinformation数(leftventricularejectionfraction,LVEF)和短轴缩
regulator1,SIRT1)是细胞内一种重要的去乙酰化短率(leftventricularfractionalshortening,LVFS)。
酶, HE染色观察心肌纤维结构变化
护作用[14-16]。然而,SIRT1在二甲双胍改善Dox导Dox腹腔注射7d后,用2%***将各组小鼠
致的心脏毒性中的作用还不清楚。本研究探讨二甲麻醉,固定于小鼠手术台,快速剪开胸腔,暴露心脏,
双胍能否通过调控SIRT1信号改善阿霉素心脏毒取下心脏后放入4%多聚甲醛中固定24h。梯度脱
性,这将为二甲双胍在阿霉素心脏毒性中的应用提水复蜡,石蜡包埋后将蜡块切成薄片,采用常规HE
供实验依据。染色方法观察心肌纤维的变化。
TUNEL染色检测心肌细胞凋亡程度
1 材料与方法
严格按照Roche公司TUNEL染色试剂盒说明
动物与试剂书的步骤,将心肌组织石蜡切片行脱蜡复水后,PBS
从西安交通大学实验动物中心购买60只雄性洗3次,%TritonX-100室温处理15min,
成年C57/BL6小鼠,体质量在25~30g;Met和DoxPBS洗3次,将TUNEL反应液滴加在组织切片上,
购买于美国Sigma公司;LDH含量检测试剂盒购自37℃避光孵育30min,PBS洗3次,避光滴加DAPI
上海碧云天生物技术有限公司。cleavedCaspase-3、染色,37℃避光孵育10min,滴加50%甘油封片,激
Caspase-3、cytochromeC、PERK、p-eIF2α、GRP78、Ac-光共聚焦显微镜拍照;细胞凋亡率=TUNEL阳性细
Foxo1和GAPDH购买于美国CellSignalingTechnology胞数/总细胞数100%。
公司;SIRT1购自英国Abcam公司; Westernblot检测蛋白的表达
剂盒购自瑞士Roche公司。用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂
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解液提取各组心肌组织蛋白,BCA定量后沸水煮计学意义。
10min;蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后,湿转法转至
2 结果
PVDF膜。用5%脱脂奶粉室温封闭2h,将条带放
入以下一抗管中:抗cleavedCaspase-3(1∶1000)、 Met减轻Dox引起的心肌损伤
Caspase-3(1∶1000)、抗cytochromeC(1∶1000)、抗HE染色结果显示,sham组心肌纤维排列整齐
PERK(1∶1000)、抗p-eIF2α(1∶1000)、抗GRP78有序,Dox组心肌纤维肿胀并出现明显空泡化;与
(1∶1000)、抗Ac-Foxo1(1∶1000)、抗SIRT1(1∶1000)Dox组相比,低剂量组心肌纤维肿胀和空泡化减轻,
和抗GAPDH抗体(1∶5000),4℃孵育过夜。TBST高剂量组心肌纤维肿胀和空泡化改善更加明显(见
洗膜3次,用HRP标记的山羊抗兔和山羊抗鼠二抗图1)。与sham组比较,Dox组LVEF、LVFS以及
(1∶5000)室温孵育2h,TBST洗膜3次后用ECL化HW/TL的比值降低(P<);与Dox组相比,低
学显影液检测蛋白表达,ImageLab图像软件进行灰剂量组LVEF、LVFS和HW/TL的比值增加(P<
度值分析。),高剂量组LVEF、LVFS和HW/TL的比值进
统计学分析一步增加(P<,见图1)。与sham组比较,Dox
(P<),低剂量组血清
析,数据用均数±标准差(x-±s)表示,各组间差异比中LDH含量降低(P<),高剂量组血清中LDH
较采用单因素方差分析(One-wayANOVA),两组间含量进一步降低(P<,见图1)。
差异比较采用Tukey检验,P<
与sham组比较,ÊÊP<;与Dox组比较,*P<,**P<
图1 二甲双胍减轻Dox引起的心肌损伤(×200)
Figure1 MetforminalleviatesDox-inducedmyocardialinjury(×200)
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二甲双胍抑制Dox引起的细胞凋亡2)。TUNEL染色结果显示,与sham组比较,Dox组
Westernblot结果显示,与sham组比较,Dox组TUNEL阳性细胞数增多,细胞凋亡率增加(P<
cleavedCaspase-3、cytochromeC和Caspase-);与Dox组相比,低剂量组TUNEL阳性细胞
达增加(P<);与Dox组比,低剂量组cleaved数减少,细胞凋亡率降低(P<),高剂量组
Caspase-3、cytochromeC和Caspase-3蛋白表达降低TUNEL阳性细胞数和细胞凋亡率进一步降低(P<
(P<),高剂量组cleavedCaspase-3、,见图3)。
C和Caspase-3蛋白表达进一步降低(P<,见图
与sham组比较,ÊÊP<;与Dox组比较,*P<,**P<
图2 蛋白免疫印迹法检测二甲双胍对Dox引起的心肌细胞凋亡的影响
Figure2 EffectofmetforminonDox-inducedmyocardialapoptosisbyWesternblot
图3 TUNEL染色检测二甲双胍对Dox引起的心肌细胞凋亡率的影响
Figure3 EffectofmetforminonDox-inducedmyocardialapoptoticratebyTUNELstaining
二甲双胍抑制Dox引起的内质网应激内质网应激相关分子PERK和p-eIF2α蛋白表达增
Westernblot结果显示,与sham组比较,Dox组加,抗内质网应激分子GRP78蛋白表达减少(P<
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);与Dox组比较,低剂量组PERK和p-eIF2α量组PERK和p-eIF2α蛋白表达进一步降低,GRP78
蛋白表达降低,GRP78表达增加(P<),而高剂表达增加(P<,见图4)。
与sham组比较,ÊÊP<;与Dox组比较,*P<,**P<
图4 二甲双胍抑制Dox引起的内质网应激
Figure4 MetformininhibitsDox-inducedendoplasmicreticulumstress
二甲双胍上调Dox引起的SIRT1信号达增加,Ac-Foxo1蛋白表达降低(P<),而高剂
Westernblot结果显示,与sham组比较,Dox组量组SIRT1蛋白表达进一步增加,Ac-Foxo1蛋白表
SIRT1蛋白表达明显降低,Ac-Foxo1蛋白表达增加达降低(P<,见图5)。
(P<);与Dox组比较,低剂量组SIRT1蛋白表
与sham组比较,ÊÊP<;与Dox组比较,*P<,**P<
图5 二甲双胍上调Dox导致的SIRT1抑制
Figure5 MetforminupregulatesDox-inducedSIRT1inhibition
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质网应激反应,在阿霉素诱导的心脏毒性等多种心
3 讨论
血管疾病的发生发展中发挥关键作用[15,16]。SIRT1
阿霉素是蒽环类化疗药物,具有很强的广谱抗是胞内重要的去乙酰化酶,大量研究表明SIRT1可
癌活性,是各类癌症化疗方案中常用的抗癌药,由于通过减少细胞凋亡、抑制氧化应激和炎症反应、改善
具有较强的心脏毒性副作用,严重限制了其临床应线粒体功能等在心血管疾病中发挥重要保护作
用[3]。研究发现,尽管存在诱发心力衰竭的风险,用[14-16,22]。本研究发现,阿霉素能明显增加心肌内
阿霉素在癌症治疗方案中的使用量仍有所增加,然质网应激反应,降低SIRT1的表达,并上调乙酰化
而当累计剂量达到550mg/m2时,患者心力衰竭的Foxo1的表达;而二甲双胍能明显抑制阿霉素引起
发生风险会增加到26%[4]。因,为了增加阿霉素在的内质网应激,更为重要的是,二甲双胍可以增加
癌症治疗中的应用,如何降低其心脏毒性成为研究SIRT1的表达,并抑制乙酰化Foxo1的表达。这些
的重点。结果提示,二甲双胍通过激活SIRT1信号抑制阿霉
阿霉素引起心脏毒性的一个重要表现是心脏功素引起的内质网应激。
能降低和心肌组织病理学改变,如出现心肌纤维紊综述所述,本研究进一步证实了二甲双胍具有
乱和空泡化,以及左心室收缩功能障碍,并逐步演变改善阿霉素心脏毒性的作用,并发现其作用与激活
为心力衰竭[17]。心肌细胞凋亡导致的心肌细胞数SIRT1信号、抑制内质网应激和细胞凋亡有关。本
量减少是其重要原因。本研究发现,阿霉素导致心研究完善了二甲双胍改善阿霉素心脏毒性的作用机
脏功能障碍和心肌损伤,表现为LVEF和LVFS值明制,为其临床应用提供了可靠的实验依据。
显降低,心肌纤维排列紊乱、肿胀、空泡化,HW/TL参考文献:
比值降低,LDH含量增加;同时,cleavedCaspase-3[1] vanderZandenSY,QiaoX,
和cytochromeC蛋白表达增加,TUNEL染色阳性细activitiesandtoxicitiesoftheoldanticancerdrugdoxorubicin
[J].FEBSJ,2021,288(21):6095-6111.
胞数也明显增加。这些结果说明了阿霉素能够引起
[2] HallmanBE,HauckML,WilliamsLE,
心脏损伤。
factorsassociatedwithdevelopmentofclinicalcardiotoxicityin
二甲双胍是广泛用于治疗2型糖尿病的一线降dogsreceivingdoxorubicin[J].JVetInternMed,2019,33
糖药,可有效降低血糖,还可以降低2型糖尿病患者(2):783-791.
的全因死亡率和心肌梗死风险以及糖尿病心力衰竭[3] BhagatA,-inducedcardiotoxicity:
患者的死亡率[18]。已有研究表明,二甲双胍能够调causes,mechanisms,andprevention[J].AdvExpMedBiol,
2020,1257:181-192.
节MAPK和AMPK信号通过自噬减轻阿霉素引起
[4] RenuK,VGA,PBTP,-
的心脏毒性[19]。同时,有研究发现Met改善Dox引
cin-inducedcardiomyopathy-Anupdate[J].EurJPharmacol,
起的心脏功能障碍,降低MDA和LDH含量,并增加2018,818:241-253.
[20]
SOD活性;此外,Met通过抑制ROS生成,改善线[5] PrathumsapN,ShinlapawittayatornK,ChattipakornSC,etal.
粒体能量代谢减少细胞凋亡[21]。但二甲双胍能否Effectsofdoxorubicinontheheart:frommolecularmechanisms
通过抑制内质网应激减轻阿霉素导致的心脏毒性还tointerventionstrategies[J].EurJPharmacol,2020,866
(172818):1-17.
不清楚。本实验结果表明,二甲双胍干预阿霉素组
[6] BartlettJJ,TrivediPC,
LVEF和LVFS值增加,心肌纤维排列改善、肿胀和
indoxorubicincardiomyopathy[J].JMolCellCardiol,2017,
空泡化减轻,HW/TL比值增加,LDH含量降低;另104:1-8.
外,二甲双胍还能降低cleavedCaspase-3和cyto-[7] ShakerRA,AbboudSH,AssadHC,
chromeC蛋白表达以及TUNEL染色阳性细胞数,这doxorubicininducedcardiotoxicityinratsviainterferingwithoxi-
些结果进一步证实二甲双胍能够改善阿霉素导致的dativestress,inflammationandapoptosis[J].BMCPharmacol
Toxicol,2018,19(3):1-10.
心脏功能障碍和心肌损伤。
[8] YarmohammadiF,RezaeeR,HayeAW,
当心肌细胞受刺激后,未折叠或错误折叠的蛋
reticulumstressindoxorubicin-inducedcardiotoxicitymaybe
2+
白会聚集在内质网腔内,引起内质网中Ca稳态失therapeuticallytargetedbynaturalandchemicalcompounds:a
衡,蛋白合成和分泌失调,激活未折叠蛋白反应和内review[J].PharmacolRes,2021,164(105383):1-7.
山西医科大学学报,2022年10月,第53卷第10期 ·1267·
[9] FloryJ,[J].JAMA,2019,321inhibitsapoptosistoprotectcardiomyocytesfromhypoxicstress
(19):1926-1927.[J].IntJMolMed,2019,43(5):2033-2043.
[10] JiaW,BaiT,ZengJ,[17] O’ConnellJL,RomanoMM,CamposPuliciEC,-term
andatorvastatinattenuatesdiabeticcardiomyopathybyinhibitingandlong-termmodelsofdoxorubicin-inducedcardiomyopathyin
inflammation,apoptosis,andoxidativestressintype2diabeticrats:acomparisonoffunctionalandhistopathologicalchanges
mice[J].FrontCellDevBiol,2021,9(634900):1-14.[J].ExpToxicolPathol,2017,69(4):213-219.
[11] -dependentand-independentmodulationof[18] HanY,XieH,LiuY,-causeand
oxidativeandorganellarstressinthediabeticheartbyglucose-cardiovascularmortalit