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՟HMGB2ﻛMiR-let-7g-3p
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邹震海,程琪,李中,高五岳,孙巍,刘贝贝,郭园园,刘建民
蚌埠医学院第一附属医院泌尿外科,安徽蚌埠233004
摘要:目的探讨MiR-let-7g-3p靶向HMGB2对膀胱癌细胞生物学行为的影响及其分子机制。方法通过qRT-PCR检测膀胱癌
组织和癌旁组织以及正常尿路上皮细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞(T24、5637和EJ)中let-7g-3p的表达水平;通过转染过表达或
敲低T24细胞let-7g-3p表达,检测细胞增殖、迁移和侵袭、和凋亡等变化;对过表达let-7g-3p的细胞进行转录组测序,结合生物
信息学分析,通过双荧光素酶报告实验、qRT-PCR和Western-blot分析let-7g-3p靶向负性调控HMGB2基因;qRT-PCR检测正常
尿路上细胞和膀胱癌细胞(T24、5637和EJ)中HMGB2的表达水平,并且在敲低HMGB2的细胞株中,敲低let-7g-3p,检测细胞
生物学行为改变。结果qRT-qPCR证实let-7g-3p在膀胱癌组织和细胞表达明显下调(P<);过表达let-7g-3p可抑制细胞增
殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡(P<);相反,敲减let-7g-3p表达可促进细胞增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡(P<)。生物
信息学和转录组测序结果显示,HMGB2是let-7g-3p作用于膀胱癌细胞的关键分子;双荧光素酶报告实验、qRT-PCR和Western
blot显示,HMGB2受let-7g-3p的负性调控;HMGB2膀胱癌细胞中表达水平均明显上调(P<),敲低HMGB2可部分逆转敲
低let-7g-3p对膀胱癌细胞生长的促进作用。结论MiRNA-let-7g-3p通过靶向负性调控HMGB2基因抑制膀胱癌细胞的生物行为。
关键词:let-7g-3p;HMGB2基因;膀胱肿瘤
microRNAlet-7g-3pregulatesproliferation,migration,invasionandapoptosisofbladder
cancercellsbytargetingHMGB2
ZOUZhenhai,CHENGQi,LIZhong,GAOWuyue,SUNWei,LIUBeibei,GUOYuanyuan,LIUJianmin
DepartmentofUrology,FirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China
Abstract:ObjectiveToexplorethemolecularmechanismbywhichmicroRNAlet-7g-3pregulatesbiologicalbehaviorsof
-7g-3pinbladdercancerandadjacenttissues,normalbladder
epithelialcells(HUCcells)andbladdercancercells(T24,5637andEJcells)weredetectedusingqRT-
transfectedwithlet-7g-3pmimicorinhibitor,andthechangesincellproliferation,migration,invasion,andapoptosiswere
-7g-3p,andtheresultsofbioinformatics
analysis,doubleluciferasereportergeneassay,qRT-PCRandWesternblottingconfirmedthatHMGB2genewasthetarget
geneoflet-7g-,T24,5637andEJcells,andincellswithHMGB2
knockdown,theeffectoflet-7g--qPCRconfirmedthat
let-7g-3pexpressionwassignificantlylowerinbladdercancertissuesandcells(P<).Overexpressionoflet-7g-3pinhibited
cellproliferation,migrationandinvasion,andpromotedcellapoptosis,whilelet-7g-3pknock-downproducedtheopposite
oflet-7g-,qRT-PCRandWesternblottingallconfirmedthatHMGB2
wasnegativelyregulatedbylet-7g-3p(P<).KnockingdownHMGB2couldpartiallyreversetheeffectoflet-7g-3p
-7g-3pcaninhibitthe
biologicalbehaviorofbladdercancercellsbynegativelyregulatingHMGB2gene.
Keywords:let-7g-3p;HMGB2;bladdercancer
膀胱癌是目前最常见的9大癌症之一,在所有新诊且在所有实体癌中,膀胱癌的复发率最高[1,2]。经一线治
断的病例中,75%表现为非肌肉浸润性膀胱癌疗后,50%~70%的NMIBC患者会在5年内复发,10%~
(NMIBC),25%表现为肌肉浸润性膀胱癌(MIBC),并30%的患者将进展为MIBC[3]。可见,如何降低膀胱癌
复发率,改善患者生存预后是膀胱癌领域的重要问题。
收稿日期:2022-04-10
基金项目:国家自然科学基金(81702495);安徽省卫健委科研项目重点项微小核糖核酸(miRNAs)是一种小的非编码核糖
目(AHWJ2021a007);安徽省高校自然科学研究项目重点项目核酸,由19~25个核苷酸组成[4]。目前,已有多种
(KJ2021A0706);蚌埠医学院科技项目(2020bypd008);蚌埠医学院研究miRNAs在癌症中被证明是促癌基因(如miR-92和
生创新计划项目(Byycx21074)
miR-194)或抑癌基因(如miR-199b和miR-99a)[5-8]。然
SupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(81702495).
而在膀胱癌中,还有许多下调miRNAs尚未得到充分的
作者简介:邹震海,在读硕士研究生,E-mail:******@
通信作者:刘建民,主任医师,Email:liu_john_******@,其功能和靶基因有待进一步阐明。let-7g-3p是定
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位于3号染色体上属于let-7基因家族编码的一种表1RNAOligo序列
miRNAs,let-
负性调控ras表达来发挥致癌作用[9]。let-7g-3p参与多GeneSequence(5'-3')
种人类代谢性疾病,例如阿尔茨海默症、肿瘤以及miR-NC-senceUUCUCCGAACGUGUCACGUTT
Graves病等[10,11]。在肿瘤研究方面,研究发现let-7g-3pmiR-NC-antisenceACGUGACACGUUCGGAGAATT
参与细胞外基质中受体的相互作用并且与癌症中的蛋let-7g-3p-mimics-senceCUGUACAGGCCACUGCCUU
白多糖的合成有关,该机制与小儿星形细胞瘤的发生发let-7g-3p-mimics-antisenceAAGGCAGUGGCCUGUACAG
展有关[12]。但目前尚未有研究报道let-7g-3p对膀胱癌let-7g-3p-inhibitor-senceGCAAGGCAGUGGCCUGUACAG
生物学行为的影响并且其下游的相关信号因子和潜在let-7g-3p-inhibitor-antisenceAUGUCAGGCCACUGCCUUGC
机制仍然未知。si-NC-senceAGGUUUACAUGUUCCAAUAUG
因此本研究将let-7g-3p作为研究对象,通过多种si-NC-antisenceUAUUGGAACAUGUAAACCUGG
实验方法,旨在明确let-7g-3p靶向HMGB2抑制膀胱癌si-HMGB2-senceCUGCAAAGGAGAAGUCGAATT
的作用和分子机制,为临床治疗膀胱癌提供潜在的治疗si-HMGB2-antisenceUUCGACUUCUCCUUUGCAGTT
靶点和理论依据。
吸取100μL加入上室。下室加入含20%胎牛血清的
1材料和方法℃
1640培养基。37恒温培养箱中培养24h后,轻轻
去除上室中的细胞和Matrigel胶,4%多聚甲醛固定
正常人尿路上皮细胞系SV-HUC-1,以及膀胱癌
30min后结晶紫染色,显微镜下拍照并分析。细胞迁移
细胞系T24、5637和EJ(中国科学院上海细胞库);
实验中,Transwell上室不加入Matrigel胶,其余步骤同
RPMI1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗和胰
细胞侵袭实验,实验重复3次。
酶(Gibco);脂质体转染试剂Lipo2000、TRIzol、
PowerUpSYBRGreenMasterMIXPCR试剂盒和山羊
收集转染后的细胞,取5~10万重悬的细胞,1000g
抗兔二抗(ThermoFish);逆转录试剂盒(Takara);
离心5min,弃上清。195μLAnnexinV-FITC结合液重
mimics-NC、let-7g-3pmimics、Inhibitor-NC、let-7g-3p
悬细胞。加入5μLAnnexinV-FITC,10μL碘化丙啶染
inhibitor、si-NC以及si-HMGB2均由上海吉玛公司设计
色液,混匀后室温孵育10~20min,流式上机检测,实验
并合成;HMGB2抗体(Abcam)。
重复3次。
所有组织样本均来源于在蚌埠医学院第一附属医
根据说明书,使用Trizol试剂从组织和细胞中分离
院纳入治疗的BLCA患者,患者他们均未在术前接受放
总RNA,反转录成互补脱氧核糖核酸(cDNA),
疗或术前化疗。所有标本均按医学伦理规范进行处理。
PowerUpSYBRGreenMasterMIXPCR试剂盒用于测
定let-7g-3p的表达水平(U6作为内参基因),SYBR
正常人尿路上皮细胞系HUC,以及膀胱癌细胞系
GreenMix用于测定HMGB2(GAPDH作为内参基因)
T24、5637及EJ细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640℃℃
℃的表达水平。95预变性1min后,95变性20s,
培养基中培养。培养箱条件、。当细胞融合
375%CO2℃
60退火20s,共40个循环,2-ΔΔCt法用于计算目的基因
度在80%%胰酶消化传代,每2d换液或传
的相对表达量。(表2)。
代1次。在其生长状态良好时,将T24细胞接种于6孔板
中,生长至60%融合度,按照Lipofectamine2000试剂说
表2引物序列
明书,将miR-NC、let-7g-3p-mimics、let-7g-3p-inhibitor、
si-NC以及si-HMGB2、转染入细胞(序列见表1)。
GenePrimersequence(5'-3')
将转染后的T24细胞接种于96孔板中,分别培养let-7g-3p-FCGCGCTGTACAGGCCACTG
℃
24、48、72h后,每孔加入10μLCCK8溶液,避光,37U6-FCGCTTCGGCAGCACATATACTAA
条件下孵育1h,酶标仪检测细胞在450nm处的吸光度Micro-RAGTGCAGGGTCCGAGGTATT
值,实验重复次。HMGB2-FCGGGGCAAAATGTCCTCGTA
A450nm3
-RCGGAAGAGTCCGGGTGTTT
收集转染后的细胞,细胞侵袭实验中,上室面制备GAPDH-FGGAGCGAGATCCCTCCAAAAT
Matrigel胶后,将细胞用无血清培养基调整为2×105/mL,GAPDH-RGGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
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收集转染和后的
mimics-NClet-7g-3p-
细胞,每组各3个样本,采用TRIzol试剂提取总RNA,
Nanodrop分光光度计(ND-ONE-W)检测RNA样品的
3
纯度、浓度和完整性,进行文库构建,加入g-
**
FragmentationBuffer将mRNA进行随机打断,
mRNA为模板,
eaielet-Relative
链,然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNA0
polymeraseI合成第二条cDNA链,利用AMPureXP磁NormalTumour
珠纯化cDNA,纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A图1let-7g-3p在膀胱癌组织中的表达水平
-7g-3pinbladder
尾并连接测序接头,然后用AMPureXP磁珠进行片段
cancertissues(n=5,**P<).
大小选择,最后通过PCR富集得到cDNA文库。文库
构建完成后,使用Q-PCR方法对文库的有效浓度(文库
有效浓度>2nmol/L)进行准确定量,以保证文库质量。
库检合格后,不同文库按照目标下机数据量进行混合,
用Illumina平台进行测序。
g-
收集细胞后使用冷PBS洗涤两次,**
℃
**
液冰上裂解30min,将裂解物以4,12000r/min离心**
15min,
eaielet-Relative
0
白质浓度。在SDS-PAGE上加入等量的蛋白质样品并SV-HUC-1T245637EJ
转移到PVDF膜上,随后使用5%脱脂奶粉封闭1h,
℃
4孵育一抗摇床过夜。第2天二抗室温孵育1h,TBST图2let-7g-3p在膀胱癌细胞中的表达水平
-7g-3pinbladder
洗3次,使用化学发光试剂观察蛋白质条带并使用cancercellslines(n=3).**P<-HUC-1.
ImageJ进行分析。
构建HMGB2野生型及突变型质粒,将细胞接种于si-NC以及si-HMGB2、转染入膀胱癌细胞后,通过qRT-
6孔板中,分别或同时转染HMGB2野生型质粒、PCR进行了转染效率的验证,结果显示T24细胞中let-
HMGB2突变型质粒、mimics-NC和let-7g-3pmimics,7g-3p和HMGB2的表达水平被成功敲低和过表达,差
用双荧光素酶报告基因试剂盒检测各组荧光素酶活性。异有统计学意义(P<,图3)。
-7g-3p对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的
数据分析处理。计量资料以均数±标准差表示,两组间CCK8增殖实验显示,与mimics-NC组相比,let-
比较采用t检验,以P<。7g-3pmimics组的T24细胞的增殖能力明显减弱(P<
,图4A);Transwell迁移和侵袭实验显示,细胞的
2结果迁移和侵袭能力均减弱(P<,图4B、C);流式细胞
-7g-3p在膀胱癌中的表达水平术分析显示,let-7g-3pmimics组的T24细胞凋亡增加
与癌旁组织相比,膀胱癌组织中let-7g-3p的表达(P<,图4D)。反之,与inhibitor-NC组相比,let-7g-3p
水平下降,差异有统计学意义(P<,图1)。inhibitor组的T24细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显增
与正常尿路上皮细胞SV-HUC-1相比,膀胱癌细胞强,且凋亡减少。
系T24、5637和EJ细胞中let-7g-3p的表达水平下降,-7g-3p和HMGB2的靶向关系
异有统计学意义(P<,图2)。其中T24细胞的表达为寻找let-7g-3p下游的目的基因,我们对过表达
水平最低,且在膀胱癌细胞系中,T24侵袭性较强,因此let-7g-3p的T24细胞进行了转录组测序,同组样本的生
后续选择T24细胞作为实验对象。物学重复相关性均在99%以上,经过测序质量控制,共
-7g-,结果显示let-7g-3pmimics
将miR-NC、let-7g-3p-mimics、let-7g-3p-inhibitor、组与mir-NC组相比共有1597个差异表达的基因,其中
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**
**
expressionp
2
g-
**
00
eaieHMGBRelative
eaielet-Relativesi-NCsi-HMGB2
pp
-33
gg-
7cs7tor
Let-mimiLet-
Mimics-NCInhibitor-NCinhibi
图3let-7g-3p和HMGB2转染效率的验证
-7g-:let-7g-3pwas
successfullyknockeddownorover-:HMGB2
wassuccessfullyknockeddowninbladdercancercells.**P<(n=3).
Let-7g-3pmimicsLet-7g-3pinhibitor
nm****
450
450
A
02448720244872
Cellproliferationtime(h)Cellproliferationtime(h)
**
CMimics-NCLet-7g-3pmimicsInhibitor-NCLet-7g-
**
0
Migration
eaiemgainratemigrationRelativep
p3
-3
gg-
7cs7tor
Let-Let-
mimiinhibi
Mimics-NCInhibitor-NC
DMimics-NCLet-7g-3pmimicsInhibitor-NCLet-7g-**
**
0
eaieivsorateinvasionRelativep
p3
-3
gg-
7cs7tor
Let-Let-
mimiinhibi
Mimics-NCInhibitor-NC
25
EMimics-NCLet-7g-3pmimicsInhibitor-NCLet-7g-3pinhibitor**
20
15
10**
5
ppoiae(%)rateApoptosis0
p
p3
-3
gg-
7cs7tor
Let-Let-
mimiinhibi
Mimics-NCInhibitor-NC
图4let-7g-3p对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响
-7g-3ponproliferation,migration,,B:CCK8assayfor
assessingtheproliferationabilityofT24cellswithlet-7g-,D:Transwellassayforassessing
migrationandinvasionabilityofT24cellswithlet-7g-3pknockdownoroverexpression(Originalmagnification:×100).E:Flow
cytometryforassessingapoptosisofT24cellswithlet-7g-3pknockdownoroverexpression.**P<(n=3).
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有718个上调基因和879个下调基因(图5A)。接着以其中,HMGB2基因在测序结果中显示表达下调,并且
let-7g-3p为结合靶点,从Targetscan,MiRDB和miRT-在线数据库都表明let-7g-3p和HMGB2之间存在结合
abase这3个在线数据库中获取了let-7g-3p的下游目的位点(图5C、D),因此,我们选择HMGB2作为let-7g-3p
基因并取交集,最终共有31个基因纳入考虑(图5B)。的下游靶标并进行了进一步的验证。
AB
P<
Flchange)(Fold
2
log
-log10(pvalue)
CD
图5let-7g-3p与HMGB2的靶向关系
-7g-::Waynediagramof
::
Bindingsitebetweenlet-7g-3pandHMGB2.
双荧光素酶报告实验的结果显示,在野生型A
HMGB2中,转染let-7g-3pmimics的293T细胞的荧光
素酶活性显著降低(P<),同时在突变型HMGB2
中,两者之间无明显差异(P>,图6)。为明确let-7g-
3p如何调控HMGB2,进一步进行qRT-PCR实验,结果
显示,let-7g-
**NC
mimics-NC组相比明显下调(P<,图7A),Western
**Hsa-let-7g-3pmimics
blot结果显示let-7g-
mimics-NC组相比下调(P<,图7B、C)。而在过表达
HMGB2后let-7g-3p的表达水平无明显变化(P>,
图7D)。activityLuciferase
与正常尿路上皮细胞SV-HUC-1相比,膀胱癌细胞
Coutrol
'UTR-WT
-3'UTR-MUT
系T24、5637和EJ细胞中HMGB2的表达水平上调,差2-3
2
异有统计学意义(P<,图8)。HMGB
HMGB
-7g-3p靶向HMGB2对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵
图6双荧光素酶报告实验的结果
CCK8细胞增殖实验显示敲低HMGB2部分逆转geneassay(n=3,**P<).
了敲低let-7g-3p促进膀胱癌细胞增殖的作用(P<,
侵袭的作用(,图、);流式细胞术的结果显
图9A);Transwell迁移和侵袭实验显示,敲低HMGB2P<
示,敲低可以增加抑制的细胞凋亡
同样能够逆转敲低let-7g-3p促进膀胱癌细胞迁移和HMGB2let-7g-3p
·1340·JSouthMedUniv,2022,42(9):1335-1343-
2
β-
p
3
GB
ression
ression
g-
7
**
HMGB2
***
-NCLet-7g-
eaieHMRelative
eaieHMRelative
rtiexpprotein
RAexpmRNA
rtiexpprotein
-
000
p
3psi-Ncsi-HMGB2
--3
gg
7cs7cs
Let-Let-
Mimics-NCmimiMimics-NCmimi
图7过表达let-7g-3p可以显著降低HMGB2的表达水平
-7g-:Overexpressionoflet-7g-3preducesthe
mRNAexpressionl