文档介绍：南开大学
博士学位论文
毕赤酵母Δ<'12>/ω3-脂肪酸脱氢酶功能与结构的研究
姓名:张昕欣
申请学位级别:博士
专业:微生物学
指导教师:邢来君
20080401
中文摘要为研究巴斯德毕赤酵母中多不饱和脂肪酸的合成机制,根据已报道的真菌得到全长为的核苷酸序列信息,其中包括的氨基酸编码区和为进一步验证该∞舅嵬亚饷傅牡孜锾匾煨裕直鸺尤氩煌类不饱和脂肪酸脱氢酶一种催化亚油酸生成锹樗岬拿咐唷R虼宋颐强梢越徊酵贫酶催化油酸生成亚油酸,ú嗖槐ブ舅岬幕蚬こ叹甑慕好选择。因此,有必要对毕赤酵母多不饱和脂肪酸的合成途径及其合成途径中相关酶类进行系统的研究。△.脂肪酸脱氢酶同源序列中保守的氨基酸序列设计简并引物进行峁玫饺ǔの,编码霭被岬钠段。通过其编码的氨基酸序列的相似性搜索表明,∩:。为了验证所获得序列的功能,将潜在的编码序列转化到受体菌中进行表达。通过气相色谱和气质联用甅分析表明:,。该基因序列已经注册到的序列接收号为脂肪酸作为底物进行诱导表达。结果发现唤瞿芄皇侗鹧怯退嶙魑5孜进行催化,、,且催化活性大致相同。。利用同源重组介导敲除的办法构建了巴斯德毕赤酵母△一脂肪酸脱氢酶基因缺失突变株和脂肪酸脱氢酶基因缺失突变株,并对缺失突变株的总脂肪酸进行了分析和杂交验证。分析结果证明△.脂肪酸脱氢酶是巴斯德毕赤酵母中唯一催化油酸生成亚油酸的酶类,巴斯德毕赤酵母中只有∞出巴斯德毕赤酵母体内多不饱和脂肪酸的代谢途径是:首先由舅嵬亚。
应基因的缺失,而且回补株中缺失基因的产物占总脂肪酸的百分含量都相应的再将相应多不饱和脂肪酸脱氢酶基因置于强启动子后回补其突变,从而获得高保守区所在的亲水区和擞卫肭诘奈恢谩9菇ń舅嵬亚饷富的该部分序列替换成△.脂肪酸脱氢酶基因中相应序列的嵌合体,并将其转入酒酵母中进行表达,:巴斯德毕赤酵母,舅嵬亚饷福舅嵬亚饷福寺『捅酸。分别将巴斯德毕赤酵母△.,总脂肪酸成分分析结果发现△.。因此认为:通过缺失多不饱和脂肪酸脱氢酶基因构建突变株,然后产相应多不饱和脂肪酸脱氢酶产物的工程菌株,是一种值得尝试的构建产多不饱和脂肪酸基因工程菌株的方法。△.脂肪酸脱氢酶进行结构分析,并且参照前人对膜整合的脂肪酸脱氢酶结构与功能关系的研究结果,确定△眩/∥.脂肪酸脱氢酶中三个组氨酸酿酒酵母中进行表达,发现以脂肪酸脱氢酶为母体的嵌合体失去了酸脱氢酶的活性,反而具有了△.脂肪酸脱氢酶的催化功能。因此推断出决定巴斯德毕赤酵母膜整合的舅嵬亚饷竿亚饣频陌被嵝蛄惺粲谥舅脱氢酶中三个组氨酸保守区所在的亲水区和擞卫肭=徊降谋榷园退沟毕赤酵母和克鲁维氏酵母中处于三个组氨酸保守区所在的亲水区和擞卫肭的脂肪酸脱氢酶/△.脂肪酸脱氢酶氨基酸序列,/△.脂肪酸脱氢酶酶种类保守性的霭被嵛坏愫痛τ贑端的个极不保守的氨基酸位点进行突变。利用搭桥姆椒ü菇ㄍ槐涮澹渥H肽肪酸脱氢酶的活性,反而具有△.脂肪酸脱氢酶的催化功能。可以得出结论:个氨基酸位点和处于说黾ú槐J氐陌被嵛坏愣杂诰龆ㄍ亚饣破主要作用。达,缺失突变株,膜整合脂肪酸脱氢酶,脱氢机制中文摘要Ⅱ
.,籆瓼只,∞’一—瑆....’
..,.,瓽..琣
:痚痑.,日,,
砌月矽日学位论文作者签名:张叨钦南开大学学位论文版权使用授权书本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定,同意如下各项内容:按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本;学校有权保存学位论文的印刷本和电子版,并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文;学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务;学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版;在不以赢利为目的的