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创造新材料培育新品种开发功能食品
快速繁殖稀有材料材料的指纹分析新基因挖掘、定位、辅助育种等第一章
?植物组织培养的应用:
?(1)快速繁殖和规模化生产
?(2)培养无病毒植株
?(3)培育转基因植物
?(4)突变体筛选
?(5)制成人工种子
?灭菌的方法和原理
?(1)灭菌方法
?物理灭菌:高温高压灭菌干热灭菌射线照射灭菌过滤灭菌
?化学灭菌:熏蒸灭菌消毒液灭菌
?(2)灭菌原理
?(a)局温局压火菌
?原理:将待灭菌的物品放在一个密封的高压高温灭菌锅内,在121C高温和每平
方厘米1个大气压下,一般持续15-20min,就可杀死一切微生物的营养体及其弛子,适于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。
?(2)过滤灭菌法
?原理:,使液、气体通过滤膜流入无孔瓶中。
?培养基的种类和特点
?目前发展出的培养基有几十种,但常用的有MSB3white、N&SHKM8梏。
?(1)MS培养基
?1962年Murashige和Skoog为培养烟草组织时设计的,是目前应用最广泛的一种培养基。
?无机盐浓度高,养分平衡,尤其是铉盐和硝酸盐的含量很大?它不适合生长缓慢、对无机盐浓度要求比较低的植物,尤其不适合铉盐过高易发生毒害的植物。
?与MS^养基基本成分较为接近的还有LS、R啪养基,LS培养基去掉了甘氨酸、盐酸毗哆醇和烟酸;RM培养基把硝酸铉的含量提高到4950mg/L,磷酸二氢钾提高到510mg/L。
?(2)White培养基
?1943年由White设计的,1963年做了改良。
?无机盐浓度较低
?适于生根培养
?(3)N6培养基
?1974年,朱至清等学者为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的
?KNO痢(NH42SO4含量高,不含钳
?适于花粉和花药培养。
?(4)B5培养基
?1968年由Camborh等设计的?含有较低的铉盐,较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。铉盐可能对不少培养物的生长有抑制作用
?适合于某些双子叶植物特别是木本植物的生长。
?(5)SH培养基
?1972年由SchenkHid和Hidebrandt设计的。
?它的主要特点与B5相似,不用(NH可2SO4,而改用NH4H2PO,4是无机盐浓度较高的培养基
?在不少单子叶和双子叶植物上使用,效果很好。
?KM8P
?KaoandMichayluk1975
?有机成分较复杂,它包括了所有的单糖和维生素,呼吸代谢中的主要有机酸。
?主要用于原生质体培养
?培养基的成分及配制方法培养基中包括植物生长必需的15种营养元素和某些生理活性物质,可概括为四大类:
1、无机营养物:植物生长发育中非常重要镁(Mg)是叶绿素分子的一部分钙(Ca)是细胞壁的组分之一氮(ND是各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要组成部分此外,铁(Fe)、锌(Zn)和钳(Mo)等是某些酶的组成部分。
植物除了碳(C)、氢(用和氧(O)夕卜,已知还有12种元素对于植物的生长是必需的,它们是氮(N)、磷(P)、钾(K)、硫(S)、钙(Ca)、镁(Mg)、铁(Fe)、镒(Mrj)、铜(Cu)、锌(Zn)、硼(B)和铝(Al)。
前6种元素需要的数量较大,称之为大量元素或主要元素后6种元素需要的数量较小,称为微量元素或次要元素按照国际植物生理协会的建议,,、有机营养成分
主要包括碳源(糖类)和维生素类
?最常用的碳源是蔗糖和葡萄糖
?使用浓度为2吮5%
?作为植物生长发育所需的营养物质
?调节培养基中的渗透压维生素:
硫胺素(维生素B1)一般认为是一种必需的成分
毗哆醇(维生素B6),烟酸(维生素B3),泛酸钙(维生素B5)和肌醇也都能显著地改善培养的植物组织生长状况3、植物生长调节物质(激素)主要有五大天然激素(和人工合成的生长调节物质生长素):
植物五大天然激素的合成部位呵噪乙酸分生组织、种子细胞分裂素根尖赤霉素生长的种子脱落酸、乙烯成熟、衰老和环境条件4、其他附加物不是植物生长所必需的,但对细胞生长有益
凝固剂?琼脂(agar)是固体培养基的必要成分,琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物,本身并不提供任何营养
?琼脂能溶解在热水中,成为溶胶,冷却至40C即凝固为固体状凝胶。
抗生素
?抗生物质(antibiotic),包括青霉素、链霉素、庆大霉素等,用量在5—20mg/L之间?添加抗生物质可防止菌类污染,减少培养中材料的损失,尤其是快速繁殖中,常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物,采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间
活性炭?活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构,它结构疏松,孔隙大,吸水力强,有很强的吸附作用
?—l0g/L
?活性炭(activecarbon)可以降低组织培养物的有害代谢物浓度,对细胞生长有利培养基的制备1、母液的配制
配制母液有两个好处:
?可减少每次配制称量药品的麻烦
?减少极微量药品在每次称量时造成的误差
大量元素母液:
?可配成10倍母液,用时每配1000ml培养基取100ml母液
微量元素母液
?因含量低,一般配成100倍甚至1000倍,每配1000ml培养基取10ml或1ml
铁盐母液
?必须单独配制,若与其它元素混合易造成沉淀
有机化合物母液?主要是维生素和氨基酸类物质,这类物质不能配成混合母液,一定要分别配成单独的母液,,1,10mg,使用时根据需要量取
激素
?每种激素必须单独配成母液,,,多数激素难溶于水,2、培养基的配制
分别按配方逐个加入各种贮备液,包括生长调节物质和其他的特殊补加物。
充分混合之后,用1mol/LNa0H和1mol/LHCl调节培养基的pH。一般来说,,当pH高于6时,培养基将会变硬,低于5时,琼脂就不能很好地凝固。
称出规定数量的蔗糖或葡萄糖,加水直到培养基最终容积。
加入一定数量的凝固剂(琼脂或非态胶),加热融化
把培养基分装到所选用的培养容器中,每个25x150mm勺试管约装培养基15m1;每个100ml三角瓶约装50ml。
用封口膜封口
灭菌(高压灭菌)
对于不能用高压灭菌的药品来讲,经过滤灭菌后的药液等到高压灭菌的培养基冷却到大约60C时,在超净工作台加入到培养基中,摇匀。
第二章看护培养:将发育正常的胚的胚乳作为看护组织,进行胚乳发育障碍胚的离体培养。
胚培养的意义克服远缘杂交不亲和性和杂种不育性,获得种间或属间杂种获得单倍体植株克服种子休眠,提早结实缩短育种周期,提高育种效率种子生活力的快速测定稀有植物的繁殖(使种子无生活力或胚发育不全的植物获得后代)离体胚培养时,胚发育几种可能途径
胚胎发育途径:幼胚经过心形期,再发育到鱼雷形期,进而进入子叶期,最后萌发成苗。这是幼胚培养成功的途径。
早熟萌发途径:幼胚从心形期发育到鱼雷形期后,不经过子叶期直接发育成苗,即跳过某一个发育阶段,这样的幼苗往往很弱小,组织不健全,且难于培养成正常的植株。
产生愈伤组织:幼胚培养过程中细胞脱分化产生愈伤组织。通过幼胚培养产生的愈伤组织,经植株再生同样可得到远缘杂种。据报道,由胚培养产生的愈伤组织较其它外植体容易得到再生植株。
停止生长或幼胚死亡。非常小的幼胚进行培养时,接种后常遇到细胞生长停滞,如不采取一些拯救措施,幼胚细胞即死亡。
第三章愈伤组织:是指将植物上的某个部分切下,形成外植体,接种到适宜的培养基上培养,其外植体组织的增生细胞产生的一团不定形的疏松排列的薄壁组织脱分化:使已分化的体细胞,在人工诱导的条件下回复到未分化的原始状态并具有细胞全能性表达潜力的过程再分化:处于脱分化状态的愈伤组织,再度分化成其他类型的细胞、组织、器官,甚至最终再生成完整植株的过程细胞全能性:所谓细胞的全能性,?就是植物的每个细胞都具有该植物的全部遗传信息和发
育成完整植株的能力。
从理论上讲,生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。
差异:(1)受精卵的全能性最高(2)受精卵分化后的细胞中,体细胞的全能性比生殖细胞的低。
体细胞胚胎发生:体细胞胚胎发生:在离体培养条件下,植物体细胞形成胚性细胞,然后经过一系列形态学及生物化学的变化形成类似合子胚结构的过程。
愈伤组织诱导的形成过程(三个时期)植物愈伤组织诱导(callusinducing):
使那些已分化的体细胞包括离体的器官、组织和细胞在人工培养基上,经多次细胞分裂而失去原来的分化状态,形成无结构的愈伤组织或细胞团的过程大致经历起动期,分裂期和形成期3个阶段
起动期(诱导期),外植体已分化的活细胞在外源激素的作用下,通过脱分化起动而进入分裂状态,开始形成愈伤组织。
⑵分裂期:
外植体切口边缘开始膨大,外层细胞通过一分为二的方式进行分裂,从而形成一团具有分生组织状态细胞的过程。
⑶形成期:
外植体的细胞经过诱导,分裂形成了具有无序结构的愈伤组织时期植株再生的两个途径及其比较(这里不太确定,你们可以看看课件)
植株再生的两种途径:器官发生(organogenesis)和体细胞胚胎发生(somaticembryogenesis)
体细胞胚胎发生:在离体培养条件下,植物体细胞形成胚性细胞,然后经过一系列形态学及生物化学的变化形成类似合子胚结构的过程。
体细胞胚是一个二极结构,不物理地附着于原组织,每一个体细胞胚称为胚状体,它可以同合子胚一样发育成植株。
器官发生:是指培养条件下的组织或细胞团(愈伤组织)分化形成不定根(adventitiousroots)、不定芽(adventitiousshoots)等器官的过程。
两种形态发生的结构特点
胚状体途径形成的植株细胞内出现方向相反的两极分化,具有根端和芽端两个分生中心不定胚维管组织与外植体维管组织不相连具有典型的胚胎形态发生过程形成的幼苗具有子叶胚状体发育的苗,根和芽齐全
器官途径形成的植株单向极性,单个分生中心直接分化为器官不定芽和不定根与愈伤组织的维管相连,无胚胎形态不定芽的苗无子叶先长芽后长根,或先长根后长芽影响器官发生的因素
化学因素
?早期烟草组织的研究,器官发生的表达可被外源化学物质控制-高浓度的生长素和低浓度的分裂素可以促使细胞连续繁殖一一无组织的生长-高浓度的分裂素能引起茎-芽(shoot-bud)形成
?auxion/cytokinin之比值的变化成为特定的器官、根或芽分化的一个参数-生长素促进根分化,分裂素促进芽分化-生长素与根形成有关,同时对于愈伤组织的保持也是必须的-在促进芽的分化中,BAP(节氨基喋吟)是最有效的
物理因素
?光:
-很多光照条件下,一些植物均能进行器官发生,说明光周期并不是非常重要的因子-有的植物在光、暗交替条件下才能形成芽,而在连续光照下则不能-尽管如此,多数植物需要一个稳定的光周期,多数培养条件是14-16h光照,8-10h黑暗
?温度:不同植物不一样,需要摸索,如烟草和棉花就不一样影响胚状体发生和发育的因素1影响胚状体发生和发育的外部条件
.植物激素生长素类物质胡萝卜胚状体的发生可分为两个阶段外植体细胞的脱分化、愈伤组织的诱导、胚性细胞或细胞团的形成,培养基必须含有生长素类物质,主要是2,4-D胚状体的形成和发育,必须在降低2,4-D浓度或完全去除2,4-D的培养基上才能进行其它生长素如IAA、NAANOA2,4,5-T等的作用与2,4-D大致相同,但诱导的效果和对胚状体形成的抑制作用不完全一致绝大多数植物均属于这一模式,但不同的植物在含生长素时胚状体发育时期不一样,有的只能产生胚性愈伤,有的可达圆球胚,有的可达鱼雷胚,个别植物可发育到成熟胚这些不同发育程度的胚状体都必须在转移到无生长素或生长素含量很低的培养基上以后才能继续发育和成株细胞分裂素类物质
不仅没有诱导的作用(单独使用不能诱导愈伤),而且对已完成诱导的愈伤组织中胚状体的发生还有抑制作用。但在除去,胚状体发生能力还可能部分地恢复。
其它激素
一般ABAGA抑制胚状体发育,但有人认为,ABA对柑桔的胚状体发生有明显的促进作用含氮化合物
NH4+与NO3削作用不同
NH4+/NO3-的比例
氨基酸、酰胺等有机氮其它外部因素离子浓度、逆境胁迫、悬浮培养等2影响胚状体发生和发育的内部因素植株基因型的影响培养个体的遗传基础决定了离体培养的反应能力不同种的植物甚至同种植物的不同品种(或不同地理来源)个体之间,其个体基因型存在着差异,这就决定了不同的体细胞胚胎发生能力生理上的隔离细胞与其周围组织之间生理上的隔离是其进行胚状体发生的先决条件。
外植体的年龄(生理状态)与来源
少数植物如胡萝卜,几乎所有的器官都可诱导产生胚状体
大多数植物,在目前只有一定发育时期的某些器官可产生胚状体
一般以幼嫩组织作外植体较易诱导胚状体培养时间和细胞倍性变化的影响
一般由初分离或诱导的或仅经过短时期培养的愈伤组织,最易产生胚状体
随着培养时间的延长,形成胚状体的能力下降以至完全消失
培养细胞倍性的变化可能对胚状体的形成有一定影响内源激素水平的变化
外源生长素对体细胞胚产生和发育的调控是通过调节内源激素的合成、代谢、极性运输和平衡而起作用的第四章
体细胞无性系变异:体细胞培养的任何阶段所产生的变异(细胞,原生质体,愈伤组织,
再生植株等)统称为体细胞无性系变异
体细胞无性系变异的特点
1、变异广泛
包括数量性状、质量性状、染色体数目和结构变异,DNAT增和减少,生化特性变化等,以数量性状变异为主
2、变异频率高
棉花体细胞培养获得的每一个再生植株几乎都存在一定程度的变异。
3、后代稳定快
一般无性系二代就可获得稳定株系,这是优良性状选择的关键时期,从而大大地缩短育
种年限
4、潜在的隐性性状和显性性状的活化
在无性系变异后代不但出现显性性状的改变,常出现一些供体植株所没有的隐性性状的
变异如雄性不育、矮杆等
5、起点局,效率局
选用现行最好的品种(系),作为起始材料,一旦选育出就能超过现有的品种,不需要
多年的适应性试验
体细胞无性系变异的应用(这是在育种中的应用)
一、直接利用体细胞变异材料
二、利用诱变技术或进行定向选择获得体细胞变异材料
三、体细胞突变体的应用
当前在农业上,体细胞突变体筛选技术研究主要集中在抗病、抗盐、抗除草剂、抗低
温、高温等逆境胁迫的突变体筛选。
另外,在提高作物营养物质(如蛋白质、赖氨酸等)改变作物品质方面也取得了一定进展。
体细胞无性系变异育种应用中存在一些不足:
1、产生的变异多,变异类型复杂,并非所有的变异都可以稳定遗传,离体选择只对那
些在离体培养和移栽到大田环境都表现的表型变异有效,即能在后代稳定表达和遗传;
2、变异方向难以控制,难以预测,负向变异多,或有一个性状表现优良,但其它方面则呈现负向,变异并非都是新的变异;
3、筛选出的突变性状随着代数的增加,存在逐渐丧失抗性的趋势;同时一些抗性突变体的筛选与丰产性之间存在一定的矛盾;
4、植物细胞群体和微生物相比,除原生质体外,难以像微生物那样获得完全是单细胞
的群体;在离体培养时增殖速率远低于微生物,且多次继代后特别是经过相应因子筛选,
很快丧失分化能力;
5、无性系变异选择并非对所有的作物都有效,更适应于营养繁殖作物。
第五章
原生质体:指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞
由于没有细胞壁,原生质体为作物遗传改良和植物学研究提供了极为有利的试验材料。
原生质体分离方法
原生质体分离的最基本原则是保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力
一、分离方法
1、机械法分离质壁分离细胞
缺点:产量极低;应用的材料受限制;操作极费力
2、酶法分离
?酶法可在短时间内获得大量原生质体
?分为直接法和顺序法两种
?缺点是:不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可能有不同程度的毒害作用
原生质体融合的意义(应用找不到)
?物种间生殖隔离阻碍了物种之间的基因交流,从而给作物育种带来很大的局限性?原生质体融合技术是实现基因重组的一条新途径,目前利用细胞融合已从很多作物种、属间,甚至科间获得体细胞杂种,创造了一些自然界不存在的植物类型
(1)克服有性杂交不亲和和生殖障碍
?一些植物的野生材料具有很好的抗性,但与栽培品种之间存在有性杂交不亲和现象,
难以通过常规技术实现有益抗性的转移。原生质体融合不涉及到雌雄性配子,从而可以克服生殖障碍
?番茄薯或薯番茄尽管没有实际价值,但其设想还是具有很深远的意义(2)转移有利的农艺性状,创造新的种质材料
?作物栽培品种常常缺乏某些抗性性状,在栽培中处于不利地位?野生种中具有很多优良的抗性,通过原生质体融合可以将野生种的抗性转移进栽培
种中
转移胞质基因,为研究体细胞遗传提供途径和材料?植物的细胞质控制着很多优良的性状,如线粒体控制胞质雄性不育,叶绿体控制的抗除草剂特性?有性杂交的胞质成分主要为母系遗传,不可能实现杂交亲本的胞质杂交。但原生质体融合则可以达到此目的
第六章
?单倍体在遗传和育种中的应用价值
?一、在植物育种中使后代迅速纯合
?二、提高选择效率
?三、排除杂种优势对后代选择的干扰
?四、遗传研究的良好实验材料体系
?五、突变体的筛选
?六、消除致死基因
?七、选育新型自交系
?八、遗传转化的受体材料
?培养条件下小弛子的发育途径
?1)营养细胞发育途径
?2)生殖细胞发育途径
?3)营养细胞和生殖细胞并进发育途径
?4)花粉均等分裂途径
?小孑包子培养与花药培养的优势体现在哪些方面
?小孑包子培养在某些方面比花药培养有一定优势?花药培养有时会由于花药中的有害物质而不能诱导小弛子启动第一次分裂,小弛子培养则不会?花粉已是单倍体细胞,诱发都是单倍体植株或双单倍体,不含有因药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成的体细胞植株
?获得的材料总是纯合的,不管它是二倍体还是三倍体
?由于花粉能均匀地接触化学的和物理的诱变因素,花粉是研究吸收、转化和诱变的理想材料
?可观察到由单个细胞开始雄核发育的全过程,是一个很好的遗传与发育研究的材料体系
?小孑包子培养的应用
第七章
?II型限制性内切酶的特点及剪切方式
?能识别专一的核昔酸顺序,并在该顺序内的固定位置上切割双链
?识别和切割的核昔酸都是专一的,是DN济组技术中最常用的工具酶之一
?识别的专一核昔酸顺序最常见的是4个或6个核昔酸,少数也有识别5个核昔酸以及7个、8个、9个、10个和11个核昔酸的?识别顺序是一个回文对称顺序,即有一个中心对称轴,从这个轴朝二个方向“读”都完全相同
?限制性内切酶的剪切方式
?平头末端(bluntends):在同一位置上切割双链,产生平头末端?粘性末端(stickyends):交错切割,结果形成两条单链末端,这种末端的核昔酸顺序是互补的,可形成氢键
?主要DNA聚合酶的作用
?常用的DN麻合酶:
?大肠杆菌DNAM合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片断酶TaqDN麻合酶、T7DN酬合酶、TaqDNA聚合酶(PCR反应的专用酶)、RNA反转录酶
?末端转移酶、碱性磷酸化酶
?1、大肠杆菌DNA聚合酶I
?DN成合酶I的酶活性:
?
'3'的聚合酶活性;
?
'3'的外切酶活性;
?
'5'的外切酶活性(较低)
?
片断与DNM端标记
?Klenow片断:是由大肠杆菌DNA^合酶I经枯草杆菌蛋白酶的处理之后,产生出来的分子量为76KDa的大片断分子
?具有5'3'的聚合酶活性和3'5'的外切酶活性
?失去了全酶的5'3'外切酶活性
?3、T4DNA聚合酶和取代合成法标记DNA^断
?具有5'3'的聚合酶活性和3'5'的外切酶活性
?在没有dNTP3'外切酶活性便是T4DNA聚合酶的独特功能
?作用于双链DNA片断,并按3'5'的方向从3'-OH末端开始降解DNA如果反应物中存在一种dNTP时,它的水解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核昔酸时就会停止?在反应过程中,通过T4DNA聚合作用,反应物中的dNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA^断上原有的核昔酸,因此叫做取代合成
?4、T7具有5'3'的聚合酶活性和很高的单链及双链的3'5'核酸外切酶活性DNA聚合酶
?5、TaqDNA聚合酶(PC版应的专用酶)
?TaqDNA聚合酶是从极度嗜热的嗜热水生菌Thermusaquaticus中纯化得到的一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶?TaqDNA聚合酶能够在94C高温环境中存活3小时以上,具有DNA聚合酶活性和5'-3'外切酶活性
?TaqDNA聚合酶的最佳聚合温度在72C-80C之间,在60C时它的聚合活性不到最佳活性的1/2,在复性的条件下TaqDNAm合酶的活性极低
?因此利用TaqDNA聚合酶的这种反应特点可以有效地进行PCRF增反应
?TaqDNA聚合酶是以DNA的双链为模板通过变性、复性和延伸3个不同的过程来达到目的片段指数式的增长
?6、反转录酶
?一类以RNA为模板来指导DNA含成的DN成合酶,所以又称为依赖于RNA勺DNA聚合酶
?具有反转录酶活性和RNaseHB性
?主要作用是以mRN的模板合成cDNA
?对5'突出末端的DNA^断作末端标记
?7、末端核昔酸转移酶(terminaltransferase
?催化5'脱氧核昔三磷酸进行5'-3'方向的聚合作用,逐个地将脱氧核昔酸分子加到线性DN"子的3'-OH末端?不需要模板,可以用含有的3'-OHDNA片段为引物,在3'-OH端加入核昔酸达几百个?它作用的底物可以是具有3'-OH末端的单链DNA也可以是具有3'-OH突出末端的双链DNA
?8、碱性磷酸酶?用于脱去DNA(RNA5'末端的磷酸根,使5'-P成为5'-OH,该过程称核酸分子的脱磷酸作用
?当需要5'端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接(或环化)时可进行脱磷酸反应
各种载体的种类、结构、容量及特点
1、质粒(plasmid)载体
?质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA可自身复制和表达,有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因,经过适当改选后便可成为良好的载体
?克隆的质粒载体:允许外源的DNAS入,储存
?基因表达的质粒载体:允许外源DNA的插入、储存和表达
(1)质粒的生物学特性
质粒DNA勺构型:SC型共价闭合环形DNA(cccDNA)OC型开环DNA(ocDNA)L型线性DNA(cDNA>
不同质粒的分子量大小差异相当显著:106〜108D
作为载体的质粒都含有三种共同的组分:
复制基因、选择性记号、多克隆位点
质粒DNA^码着一些重要的非染色体控制的遗传性状、抗性特征、代谢特征、修饰寄
主生活方式的因子等
质粒DNA勺接合性
而转移
非接合型:不能整合到宿主的染色体上;不能通过“接合”
质粒DNA勺复制类型:
?低拷贝的质粒(1〜3):严紧型复制控制的质粒(接合型)
?高拷贝的质粒(10-60):松弛型复制控制的质粒(非接合型)
质粒的不亲合性?在同一个大肠杆菌细胞,一般不能同时含有两种不同的质粒。也称为质粒的不相容性?是指在没有选择压力的情况下,两种亲源关系密切的不同质粒,不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象
?质粒的不亲合性分子基础,主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的
2、入噬菌体载体
l噬菌体的生物学特性?l噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体,在感染宿主后可进入溶源状态,也可进入裂解循环。
?基因组为长度约为50kb的双链DNA分子。
?基因组DNA呈线性,其两端的5'末端带有12个碱基的互补单链(粘性末端,cos位点)。
?进入宿主细胞后,其两端互补单链通过碱基配对形成环状DNA分子,并随宿主细胞复制。
?经过40〜45min的生长循环,释放出约100个感染性噬菌体颗粒,或者进入溶源状态(lysogenicstate),将基因组DNA通过位点专一性重组整合到宿主的染色体DNA中,并随宿主的繁殖传给子代细胞。
?入噬菌体染色体上基因组成包括几个不同的部分:
?①噬菌体头部合成基因。包括与之对应的编码A,WB,C,D,E,F等7种不同的蛋白质基因,主要分布在入噬菌体的左侧。
?②噬菌体的尾部合成基因。包括与之相对应的编码Z,U,V,GH,MLKI,J等10种不同的蛋白质基因。
?③与入噬菌体的整合、重组等功能有关的基因,例如位于入噬菌体中部的att,int,gam,red,six基因等。
?④与入噬菌体的表达调控有关的基因。例如CIII,N,CI,cro和CII等位于入噬菌体的右半部分。
?⑤其它与入噬菌体的合成有关的基因。包括与入DNA含成有关的O,P,S,R基因等。
3、粘粒(cosmid)
由质粒和噬菌体的cos区构建而成,大小为4~6kb,容量为31~45kb
?具有l噬菌体的特性:
?具有质粒载体的特性:自主复制,带有抗性表记,易于选择阳性克隆
?高容量的克隆能力:可载高达45kb外源DNA
?因不含l的基因,故不会裂解
?便于定向克隆
4、酵母人工染色体载体(yeastartificialchromosome,YAC)?人基因组十分庞大,约含4x109bp,建立和筛选人的基因组文库,要求有容量更大的载体
?YAC含有酵母染色体端粒(telesome)、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列
?YAC是迄今容量最大的克隆载体,插入片段平均长度在200—1000Kb,最大可达2Mb
?导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆,成为人基因组研究计划的重
要工具
?YAC的主要缺点
?,即一个YAC克隆含有两个本来不相连的独立片段
?,在转代培养中可能会发生缺失或重排
?,因为YAC^酵母染色体具有相似的结构
?
5、细菌人工染色体
(bacterialartificialchromosome,BAC)
?用于基因组文库的构建物理图谱构建基因的图位克隆
主要包括oriS,repE(控制F质粒复制)和parA、parB(控制拷贝数)等成分
?具备四个功能区:
?①与BAC复制和分裂有关的基因,parA,parB,parC是parFIA分裂所必需的三个
基因,同时parB,parC与质粒的不相容性有关
?②复制起点及相关的元件,oriS是RepFIA单向复制子;repE基因编码oriS由复制
所必需的RepFIA蛋白质E?③抗生素标记基因,载体上携带的抗生素标记基因为氯霉素抗性基因,是载体的筛选标记
?④cosN,loxP分别来源于入、P1噬菌体,cosN可被入噬菌体的末端酶所切;loxP
可由P1噬菌体的Cre蛋白在loxP寡核昔酸存在时切开。这两个位点可作为特定的切点以锚定插入DNA的一端,便于限制性内切酶分析。
?BAC的优点
(转化效率比转化酵母高10-100倍)
超螺旋环状载体,易于操作
F'质粒本身所带的基因控制了质粒的复制
很少发生体内重排
克隆载体具备的条件(课本216页)
(1)克隆载体的DNA分子上通常含有1个或者多个克隆位点(多数情况下只具有一个多克隆位点)供外源的DNA^段插入到克隆载体上。
(2)携带有外源的DNA片段(基因)进入到宿主细胞中能够进行自我复制,或者外源的DNA片段能够整合染色体随着染色体的DNA复制而同步进行自我的复制。
(3)载体必须具有可供选择的标记,如抗生素标记。
(4)载体必须是安全的,不含有对受体细胞有害的基因,对于细胞的生长不会产生显著的影响。
基因克隆的方法的应用(我找不到,你们可以找找看)
第八章
一元载体、
双元载体:与Ti质粒相同,其原理主要是Ri质粒的Vir基因反式作用驱动T-DNA转移。
卸甲载体:无毒的Ti质粒载体
遗传转化中常用的选择标记基因、报告基因及其作用机制
一、选择标记基因
?在转化过程中,仅仅只有极少数植物受体细胞能获得外源基因,而其中目的基因被整合到受体植物基因组并实现表达的细胞就更少?因此,需要尽早对转化细胞进行选择,常用的且最简便的方法是使用特异性选择标记基因