文档介绍：α-半乳糖苷酶活力测定
原理
α-半乳糖苷酶能将对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖降解成对硝基酚。通过400nm比色测定释放的对硝基酚的量,可以计算反应液中α-半乳糖苷酶的活力
试剂与溶液
除特殊说明,所用的试剂均为分析纯,水均符合GB/T 6682中规定的二级水。
乙酸钠缓冲液, mol/L,
A液:;B液: mL定容至1000 mL。。
碳酸钠溶液,
,定容至1000mL。
对硝基酚标准溶液,浓度为10 mmol/ L
称取0. 1391 g 对硝基苯酚,精确到0. 001 g ,用碳酸钠溶液定容至100 mL,低温保存。
依次移取对硝基苯酚标准贮备液1 mL 、2 mL 、3 mL 、4 mL 、5 mL 、7 mL 、9 mL ,用碳酸钠溶液定容至100 mL , mmol/ L 、 mmol/ L 、/ L 、/ L 、/ L 、/ L 、/ L 的对硝基苯酚标准工作液。
对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶液,浓度为10mmol/L
-α-D-吡喃半乳糖,用醋酸钠缓冲液定容至1000mL,置棕色试剂瓶于4 ℃以下保存。
仪器与设备
分析天平: g。
pH计:。
磁力搅拌器:附加热功能。
电磁振荡器。
烧结玻璃过滤器: m。
离心机:4000 r/min。
恒温水浴锅:温度控制范围在30—60℃之间,℃。
秒表:每小时误差不超过5s。
可见分光光度计:能检测350—800nm的吸光度范围。
移液器:精度为1uL。
绘制标准曲线
吸取1mL对硝基酚标准溶液()于试管中,加入1mL乙酸钠缓冲液();对照的空白试管中加入2mL乙酸钠缓冲液();在所有的试管中加入8mL碳酸钠溶液(),振荡,在400nm处测定吸光值。
以对硝基酚浓度为Y轴、吸光值为X轴,绘制标准曲线。
反应用酶液的制备
固体样品的反应用酶液制备
称取固体样品1g左右(),用80mL乙酸钠缓冲液()浸泡,磁力搅拌30分钟,用乙酸钠缓冲液()定容至100mL,4000r/min离心机离心10min,取上清用缓冲液做适当稀释。
液体样品的反应用酶液制备
液体试样可以直接用乙酸钠缓冲液()进行稀释和定容。
,测试结果较准确。
测定步骤
将上述稀释酶液和底物对硝基酚-α