文档介绍：实验九 酶联免疫吸附试验 (Enzyme  Linked Immunosorbant Assay,ELISA)
1、掌握抗原和抗体的制备方法
2、掌握酶联免疫分析抗体效价的方法
实验目的
实验原理
用于检测包被于固相板孔中的待测抗原(或抗体)。将已知的抗原或抗体吸附在固相载体( 聚苯乙烯微量反应板) 表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除。最后通过酶作用于底物后显色来判断结果,可根据反应颜色的深浅进行定性或定量分析。
ELISA的基本原理有三条
1)抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性; 2)抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性; 3)酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅与相应抗原或抗体的量成正比例,因此可以按底物显色的程度显示试验结果。
ELISA 的特点与方法
特点:
高灵敏度——可检测ng甚至pg水平,可作定量测定;
操作简便快捷,可以同时检测数十甚至上百个样品
安全性高,污染小,干扰小
缺陷:
对试剂的选择性很高,不能同时分析多种成分;
对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应,分析分子量很小的化合物或很不稳定的化合物有一定的困难。
测定方法:常用的ELISA的测定方法分为三类:测定抗体的夹心法; 测定抗原的双抗体夹心法; 测定抗原的竞争法
1、动物免疫实验 
按1∶1的比例混匀褐腐病菌抗原与福氏完全佐剂并乳化完全后,以 剂量多点肌肉注射进行初次免疫;分别间隔2周,按1∶1的体积比混匀抗原与福氏不完全佐剂并乳化完全后,1/2剂量进行第 2、3 次免疫;然后再分别于第8、11、13周,按1∶1的体积比混匀抗原与福氏不完全佐剂并乳化完全后,。
卵黄抗体的制备方法
2、鸡卵黄抗体的提取 
使用卵黄分离器分离卵黄,去除卵清蛋白和卵黄膜,收集卵黄,加6倍于卵黄体积的蒸馏水, ,搅匀后4℃放置过夜,4℃ 10000 r/min离心25 min,取上清液待测。
3、鸡卵黄抗体(IgY)的效价检测 
以褐腐病菌抗原为包被抗原,1%BSA作封闭剂,待测鸡卵黄抗体IgY为第一抗体,辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgG为第二抗体,TMB为底物(OD)。OD450/。
实验器材:
酶标板,恒温箱,酶标仪。
实验试剂:
褐腐病菌抗原,包被液,封闭液,结合物稀释液,底物缓冲液,洗涤液,底物工作液,终止液,待测一抗,HRP标记兔抗鸡二抗。
酶标仪
操作步骤:
①特异性抗原包被于酶标版(固相载体),4℃过夜,洗涤3次。加100 μl封闭液,37℃温育1 h 。
②加100 μl待检标本,经过温育1h使相应抗体与固相抗原结合,洗涤3次,除去无关的物质。
③加100 μl酶标二抗,与已结合在固相抗体上的抗原反应,37℃温育1h。洗涤,除去未结合的酶标抗体。
④加底物显色20min,加50 µl 终止液终止反应,用酶标仪测量光密度值450/630nm,计算抗体效价。