文档介绍：冰冻切片
有关细胞和组织学技术
一、细胞和组织
免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗体检测细胞和组织内的抗原,从而达到诊断和研究疾病的目织标本质量的好坏有着密切的联系。由于各种抗原的生化、物理性质不同,如温度高低、酸碱度强弱及各种化学的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确定位。因此,细胞和组织标本的采集制备在免疫组织化学技术中占有十
(一)细胞标本的取材
目前,免疫组化技术已经应用于细胞学诊断,如鉴别低分化癌与恶性淋巴瘤、黑色素瘤、低分化肉瘤等。应用于淋巴白血病和恶性淋巴瘤的分类分型。近年来,培养细胞的免疫组化技术在鉴定细胞的种类、分化程度、研究均起到了积极作用。
细胞标本的取材有以下3种方法:
。新鲜标本以最大面积剖开,充分暴露病变区,玻片上,立即浸入细胞固定液内5-10min,取出后自然干燥,低温保存备用。
优点是简便省时,细胞抗原保存较好。缺点是细胞分布不均匀,玻片上细胞重叠,影响标记效果。
,如肝、肾、肺、淋巴结、软组织等。用细针穿刺吸抹在载玻片上,力求细胞分布均匀。如
穿刺液较多,细胞丰富,可用洗涤法:将穿刺液滴入盛有1-2ml Hanks液(低速离心5-10min后,弃上清液,将沉淀制成细胞悬液(浓度约2×106细胞/ml),吸取1滴于载玻片上,轻轻涂
该法穿刺吸取直接涂片的优点是操作简便,细胞形态保持较好。缺点是细胞分布不均匀。洗涂法片虽可弥补
、腹水、尿液、脑脊液等体液多、细胞少的标本。体液采取后,必须量的多少选用不同的处理方法:①细胞数量极多者,可吸取少量液体直接涂在玻片上。②细胞数量较少者,可将液体自离心10min,弃上清液,将沉淀涂片,略干后固定备用。
如用细胞离心涂片器(Cytospin ),可将标本用上述离心沉淀法制成2×106细胞/ml的细胞悬液,吸取50μl加入细胞分布在直径约6mm的小圆圈内,每个圆圈内的细胞数约105个(Danos,1976)。
培养细胞标本的取材可根据培养的细胞特性分别采取不同的方法。某些细胞有贴壁生长的特性,如纤维母细入培养液内即可收集到理想的细胞标本。某些细胞只能在培养液中生长,可用上述体液沉淀离心涂片法处理。
制备细胞涂片应注意:①标本反复离心洗涤,细胞的粘附性降低,在免疫组化染色过程中容易脱片,因此,试剂和便于镜下观察和记数,-,细胞总数以105个为宜。③粘液丰富的标宜作免疫组化标记。
(二)组织标本的取材
组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。前三者均为新鲜
不同程度的自溶,其抗原可能有变性消失,严重弥散现象,因此,尸检组织应尽快固定处理,以免影响免疫组化HBcAg等在尸检标本中,抗原显示仍较好。
组织标本的取材常常受到各种因素的影响,如各种内窥镜钳取的组织,常因过度挤压而变形,严重者组织结组织中分布不均一,常出现人为的组织取材不准确。为了避免上述缺点,组织取材时应注意:①活检钳的刃口必要病变区;③必须取病灶与正常组织交界区;④必要时取远距病灶区的正常组织作对照。
二、细胞和组织的固定
(一)固定
为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构,防止组织自溶,有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不和内源性酶活性,更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性,使水溶性抗原转变为非水溶性抗原,防止抗
不同抗原,其稳定性也不相同,因而对固定剂的耐受性差异较大。如T淋巴细胞表面抗原属不稳定性抗原,HBsAg属稳定性抗原,其抗原活性很少受固定剂种类、固定时间、温度等因素的影响。
(二)固定剂
用于免疫组织化学的固定剂种类较多,性能各异,在固定半稳定性抗原时,尤其重视固定剂的选择,介绍如
,其作用是使组织之间相互交联,保存抗原于原位,其特点是对组织穿透
K链和λ链的标记效果良好,背景清晰,是常用的固定剂。
(1)10%钙-福尔马林液(浓甲醛10ml,饱和碳酸钙90ml)。(2)10%中性缓冲福尔马林液(浓甲醋10ml, PBS 90ml)。(3)4%(多聚甲醛40g, ,两者混合加热至60℃,搅拌并滴加1n NaOH至清晰为止,冷却后加PBS液至总量1000ml)。
(4)戊二醛-甲醛液(戊二醛1ml,浓甲醛10ml,蒸馏水加至100ml)。
戊二醛是二醛基化合物,交联结合力比甲醛大,Bullock认为交联过强,可出现组织改变和空间遮蔽现象