文档介绍：化学发光免疫分析方法
化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其发光机理是:反应体系中的某些物质分子,如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态,当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子,对光子进行测定而实现定量分析。
化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为3 大类, 即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。
(一)化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。
1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。
鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。在碱性溶液中,鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光,其中H2O2最为常用。因发光反应速度较慢,需添加某些酶类或无机催化剂。酶类主要是辣根过氧化物酶(HRP),无机类包括O3、卤素及Fe3+、 Cu2+、 Co2+和它们的配合物。鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下,被H2O2等氧化剂氧化成3-氨基邻苯二酸的激发态中间体,当其回到基态时发出光子。,最大发射波长为425 nm。
2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析
(二)化学发光酶免疫分析
化学发光酶免疫分析( Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA
)是以酶标记生物活性物质进行免疫反应,免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物,在信号试剂作用下发光,用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP),它们有各自的发光底物。HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA 中, 使用过氧化物酶标记抗体, 进行免疫反应后,利用鲁米诺作为发光底物,在过氧化物酶和起动发光试剂(NaOH和H2O2)作用下鲁米诺发光,酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强度。此传统的化学发光体系(HRP-H2O2-lumi-nol)为几秒内瞬时闪光,存在发光强度低、不易测量等缺点。后来,在发光系统中加入增强发光剂,以增强发光信号,并在较长时间内保持稳定,便于重复测量,从而提高分析灵敏度和准确性。碱性磷酸酶(ALP)已广泛用于酶联免疫分析和核酸杂交分析。
碱性磷酸酶和1, 2-二氧环己烷构成的发光体系是目前最重要、最灵敏的化学发光体系。这类体系中具有代表性的是Bronstein 等提出的ALP-AMPPD 发光体系。 AMPPD 为 1,
Leland[3]等已对三联吡啶钌体系的电化学发光机理进行了深入的研究。电化学发光的反应在电极表面进行,发光底物为三联吡啶钌[ Ru ( b p y)32+] ,三丙***(TPA)用来激发光反应。在阳极表面,两种物质同时失去电子。在电极板上Ru (bpy)32+被氧化成Ru ( b p y)33+, TPA也被氧化成阳离子自由基(TPA+ *), TPA+ *自发地释放一个质子而变成非稳定分子(TPA*) ,将一个电子递给Ru (bpy)33+,形成激发态的Ru (bpy)32+*。 Ru (bpy)32+*在衰减的同时发射一个波长为
620 nm 的光子, 重新回到基态Ru (bpy)32+。这一过程在电极表面反复进行,产生高效、稳定的连续发光,并不断增强。