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专利名称:前列腺癌标志物spink1及其应用的制作方法
技术领域:
本发明提供用于癌症研究、癌症诊断和癌症治疗的组合物和方法,包括(但不限于)提供癌症标志物。尤其,本发明提供前列腺癌的SPINKl标志物和其他标志物。
背景技术:
前列腺癌是美国男性最常见的非皮肤性癌症,并且是患癌症死亡的第二大原因。在过去15年,已记入美国和英国的癌症登记库的前列腺癌的数目显著增长。该变化主要表明被确诊癌症的数目增长而非患癌人数的实际增长。在2006年,大概出现234,460名新增病例以及27,350个死亡病例。经判定,这些新增病例中大约91%的患者被确诊为处于局部化或局部扩散期(localorregionalstages)。前列腺癌(PCa)的经典诊断方式是直肠指诊检测和/或前列腺特异性抗原(PSA)筛选。血清PSA水平的增高可能标志着PCa的存在。因为PSA只能由前列腺细胞分泌,所以PSA被用作前列腺癌的标志物。健康的前列腺产生的PSA量稳定,一般在4ng/mL以下(或PSA读数少于等于4),而癌细胞产生的PSA量随着癌症严重程度的增加而增加。水平在4-10之间可引起医生怀疑病人有前列腺癌,而高于50的量可能意味着肿瘤已经扩散到身体其他部位。当PSA或直肠指诊检测显示极为可能存在癌症时,将用直肠超声
(TRUS)法来定位前列腺并显示任何可疑区域。使用前列腺各个部位的活组织检查来确定前列腺癌是否存在。治疗的选择取决于癌症分期。预期寿命为10年或10年以内、Gleason评分较低、肿瘤还未扩散到前列腺以外的患者常常采取观察等待法(不治疗)。对更具侵袭性的癌症治疗的选择包括:手术治疗法,如根治性前列腺切除术(RP),其中前列腺完全切除(使用或不使用神经保留术);和放射治疗法,其通过外粒子束从体外将剂量导向前列腺或者通过在前列腺中植入低剂量的放射性粒子杀死局部的癌细胞。也单独或联合手术治疗法或放射治疗法使用激素疗法。激素疗法应用黄体生成素释放激素(LH-RH)类似物来阻断垂体生成促进睾丸激素生成的激素。病人的余生都必须注射LH-RH类似物。虽然手术或激素治疗通常对局部PCa有效,但晚期疾病仍然基本上无法治愈。雄激素切除法是晚期PCa最常用的治疗方式,这导致大量的雄激素依赖性恶性细胞发生凋亡,肿瘤暂时消退。然而在大多数情况下,肿瘤发生猛烈地复发并能产生不依赖雄激素信号的增殖。PSA筛选法的出现使得可以更早地检测出PCa,明显降低了PCa相关的死亡率。PSA筛选法目前是前列腺癌唯一最好的检测方法,广泛应用于前列腺癌的诊断,但是它无法帮助确认检测出的癌症是否将引起具有临床意义的疾病。尽管PSA对已经确诊前列腺癌的随诊患者是很好的标志物,然而一些前列腺癌患者的
PSA水平可能是正常的。PAS水平中度升高(4-10ng/mL)对前列腺癌具有低特异性,且PSA水平的升高并非前列腺癌所特有。高血清PSA水平也可能与前列腺炎、前列腺梗塞、PIN、前列腺活组织检查、经尿道前列腺切除术和尿道导管插入有关。由于PSA筛选法的局限性,人们通过使用一些衍生指标(如PSA密度、年龄相关的PSA水平、TZ-PSA密度、PSA速率、游离PSA水平、复合PSA(cPSA)测定值和游离PSA与总PSA的比率)来努力提高其诊断特异性。游离PSA与总PSA的比率计量结合PSA和游离PSA在总PSA中所占百分比,其是癌症和良性肿瘤病理学又一有用的鉴定指标,特别是PSA水平中度升高(4-10ng/mL)的患者的鉴定。这个比率对确认PSA中度升高的患者在初始系统活组织检查的结果为阴性的情况下重复作活组织检查是否适合也很有用。游离PSA的百分比越低,癌症的可能性越高。因此,研究开发血清和组织中其他生物标志物来补充PSA筛选法是必要的。
发明内容
本发明提供了一种鉴定患者体内的前列腺癌的方法,包括:提供取自患者的包含前列腺细胞的样品;在包含前列腺细胞的样品内检测相较于SPINKl的正常表达的SPINKl的过度表达;以及在包含前列腺细胞的样品内检测ERG和/或ETVl的正常表达,其中,在包含前列腺细胞的样品内检测与ERG和/
或ETVl的正常表达相比互斥的SPINKl的过度表达,从而鉴定患者体内的前列腺癌。在一些实施方案中,检测步骤包括检测SPINKlRNA的过度表达。在其他实施方案中,检测步骤包括检测SPINKl蛋白的过度表达。在一些实施方案中,包含前列腺细胞的样品是前列腺组织、血液、尿液、精液、前列腺分泌物或者分离的前列腺细胞。在一些实施方案中,在包含前列腺细胞的样品内检测SPINKl的过度表达来鉴定患者体内的侵入性前列腺癌。在一些实施方案中,包含前列腺细胞的样品取自进行根治性前列腺切除术后的患者,并且SPINKl的过度表达鉴定前列腺癌在进行根治性前列腺切除术后的患者体内复发。本发明进一步提供了一种鉴定患者体内的前列腺癌的方法,包括:提供取自患者的包含前列腺细胞的样品;以及在包含前列腺细胞的样品内检测:(a)、相较于SPINKl的正常表达的SPINKl的过度表达和相较于PCA3的正常表达的PCA3的过度表达;(b)、相较于SPINKl的正常表达的SPINKl的过度表达和相较于G0LPH2的正常表达的G0LPH2的过度表达;(c)、相较于SPINKl的正常表达的SPINKl的过度表达和TMPRSS2:ERG的存在;⑷相较于SPINKl的正常表达的SPINKl的过度表达、相较于PCA3的正常表达的PCA3的过度表达和相较于G0LPH2的正常表达的G0LPH2的过度表达;(e)、相较于SPINKl的正常表达的SPINKl的过度表达、相较于PCA3的正常表达的PCA3的过度表达和
TMPRSS2:ERG的存在;(f)、相较于SPINKl的正常表达的SPINKl的过度表达、相较于G0LPH2的正常表达的G0LPH2的过度表达和TMPRSS2:ERG的存在;或(g)、相较于SPINKl的正常表达的SPINKl的过度表达、相较于PCA3的正常表达的PCA3的过度表达、相较于G0LPH2的正常表达的G0LPH2的过度表达和TMPRSS2:ERG的存在,其中,在包含前列腺细胞的样品内检测SPINKl的过度表达来鉴定患者体内的前列腺癌。在一些实施方案中,检测步骤包括检测SPINKlRNA的过度表达。在其他实施方案中,检测步骤括检测SPINKl蛋白的过度表达。在一些实施方案中,包含前列腺细胞的样品是前列腺组织、血液、尿液、精液、前列腺分泌物或者分离的前列腺细胞。另外,本发明提供一种组合物,包括以下中的至少一项:(a)包含与SPINKlRNA或cDNA特异地杂交的序列的第一寡核苷酸探针、包含与ERGRNA或cDNA特异地杂交的序列的第二寡核苷酸探针、和包含与ETVlRNA或cDNA特异地杂交的序列的第三寡核苷酸探针;(b)第一对扩增性寡核苷酸,其中在第一对扩增性寡核苷酸中每个扩增性寡核苷酸均包含与SPINKlRNA或cDNA特异地杂交的序列,第二对扩增性寡核苷酸,其中在第二扩增性寡核苷酸对中每个扩增寡核苷酸均包含与ERGRNA或cDNA特异地杂交的序列,和第三对扩增性寡核苷酸,其中每个扩增性寡核苷酸均包含与ETVlRNA或cDNA特异地杂交的序列;或(c)与SPINKl蛋白特异地结合的第一抗体、与
ERG蛋白特异地结合的第二抗体、和与ETVl蛋白特异地结合的第三抗体。本发明进一步提供了一种组合物,包括以下中的至少一项:(a)至少两种寡核苷酸探针,包括:(i)寡核苷酸探针,其包含与SPINKlRNA或cDNA特异地杂交的序列;和(ii)至少另一种寡核苷酸探针,其包含与PCA3RNA或cDNA、G0LPH2RNA或cDNA、或嵌合RNA或cDNA的接点(其中嵌合RNA的5’部分转录自TMPRSS2,嵌合RNA的3’部分转录自ERG基因)特异地杂交的序列;(b)至少两对扩增性寡核苷酸,包括:(i)、一对扩增性寡核苷酸,其中每个扩增性寡核苷酸均包含与SPINKlRNA或cDNA特异地杂交的序列;和(ii)至少另一对扩增性寡核苷酸,其中每个扩增性寡核苷酸均包含与PCA3RNA或cDNA特异地杂交的序列、每个扩增性寡核苷酸均包含与G0LPH2RNA或cDNA特异地杂交的序列、或者第一扩增性寡核苷酸包含与转录自TMPRSS2或其相应cDNA的嵌合RNA的5’部分特异地杂交的序列并且第二扩增寡核苷酸包含与转录自ERG或其相应cDNA的嵌合RNA的3’部分特异地杂交的序列;或(c)至少两种抗体,包括:(i)与SPINKl蛋白特异地结合的抗体;和(ii)至少另一种与如下蛋白特异地结合的抗体:G0LPH2蛋白、天然ERG蛋白、由TMPRSS2基因和ERG基因的融合体编码的氨基端截断的ERG蛋白、或具有由TMPRSS2基因编码的氨基末端部分和由ERF基因编码的羧基末端部分的嵌合蛋白。本发明描述了附加的实施方案。
图1示出metaCOPA鉴定了SPINKl为前列腺癌中与ERG与ETVl互斥的异常值。a、通过研究的号码对基因进行排列,在研究中任意三个预定义的百分点分割处(75th、90th、95th)它们的分值都在前100个异常值中(由COPA排列)。对排列前100个基因,根据决定其排名的研究中它们的平均COPA等级()进一步进行排列。b、在两项SPINKl被排为前100个COPA异常值的研究中显示出SPINKl的表达和ERG对SPINKl与ETVl对SPINKl表达的散布图。在两个研究中散布图显示出所有样品的ERG对SPINKl(中间部分)和ETVl对SPINKl(底部部分)。图2示出SPINKl的过度表达,其鉴定了侵入性EST阴性的前列腺癌亚群并可以通过无创性的方式检测。a_b、两支群组(密西根大学(UniversityofMichigan(UM))和瑞典观察等待中心(SwedishWatchfulWaiting(Sffff)))用免疫组织化学法(IHC)评价了曾经以荧光原位杂交法(FISH)评价TMRPSS2:ERG状态的组织芯片的SPINKl表达。a、显示了代表性的SPINKl阳性和阴性中心和来自对于由FISH重排的TMRPSS2:ERG是阴性和阳性的同一中心的细胞。b、显示了SPINKl表达和TMRPSS2:ERG状态以及两支群组Fisher精确检验的P值的列联表。c_e、SPINKl异常表达和外科切除术后生化指标复发之间的关系。Kaplan-Meier分析了(c)来自Glinsky等人的DNA芯片数据集的异常的
SPINKl表达和来自(d)UM和(e)纪念斯隆-凯特琳癌症中心(MemorialSloanKetteringCancerCenter(MSKCC))群组的SPINKlIHC检测并显示了外科切除术后的生化指标复发。f、无创性检测TMRPSS2:ERG阴性的前列腺癌患者的SPINKl异常表达。列联表示出SPINKl的异常表达和TMRPSS2:ERG的状态以及Fisher精确检验的p值。图3示出SPINKl在22RV1前列腺癌细胞中的的抑制(knockdown)削弱了癌症的侵袭性。a-b、如图所示SPINKl或LACZ腺病毒感染良性无限增殖前列腺细胞系RWPE,并且检验了该细胞系RWPE的(a)增殖或(b)穿过改良基底膜的侵袭。C、qPCR用于检测SPINK1、ERG和ETVl的异常表达。d-f、SPINKl介导22RV1细胞的侵袭性。检验了细胞的(d)增殖和
(e)侵袭。用所示siRNA处理的侵入的细胞的显微照片在f中示出。g、VCaP(TMPRSS2:ERG阳性)和g)LNCaP(ETV1重排阳性)的前列腺癌细胞系仅用转染试剂(未处理)处理,或如图所示用相对于SPINKl、ETVl或ERG非靶向性核酸或siRNA转染,并且检验侵袭。图4示出在良性前列腺组织和ETS阳性前列腺癌中荟萃异常基因(meta-outliergene)的过度表达。a、根据图1所示样品类别,所指研究显示荟萃异常基因ORM(列为4级)和NEB(列为7级)在标准化表达单元中的表达,揭示了多个良性样品中的异常表达。b、两项研究中所有定型样品的第三级荟萃异常基因GPRl16(左边部分)的表达和
GPRl16对ERG(右边部分)的散布图显示了GPR116和ERG在多个样品中的共同异常表达。图5示出在DNA芯片研究中的相较于良性前列腺组织的前列腺癌中SPINKl的过度表达和与ERG和ETVl互斥的SPINKl的过度表达。5项研究图谱分析了前列腺组织的独特类型(a)和2项研究图谱分析了作为多发性癌的一部分的前列腺癌(b),该五项研究和两项研究的SPINKl的过度表达和SPINKl对ERG与SPINKl对ETVl的散布图(如果检测)在图5中示出。图6示出与良性前列腺组织相比的前列腺癌中SPINKl的过度表达和与ERG和ETVl互斥的SPINKl的过度表达。a、示出通过qPCR研究了10例良性前列腺样品、54例局部前列腺癌(PCa)和7例转移性(Met)PCa样品而作出的ERG对SPINKl(左边部分)与ETVl对SPINKl(右边部分)的散布图。图7示出在22RV1细胞内的SPINKl抑制时差异表达的基因的qPCR证实。所选择的22RVlsiSPINKl细胞中的a)过度表达基因和b)低表达基因是通过如图所示的定量PCR来进行评价的。图8示出通过多个前列腺癌的图谱研究显示与SPINKl共同表达的基因的鉴定。图9示出前列腺癌的候选物尿基生物标志物的表征。A-C、定量PCR(qPCR)检测来自做穿刺活组织检查或前列腺切除术的患者的尿液的完整转录物组扩增(WTA)cDNA。显示了穿刺活组织检查阴性的患者或者前列腺癌患者中的生物标志物的表达。图A显示了通过单变量分析(参见表5)对前列腺癌的预测没有明显意义的基因的
-ACt值,对预测有明显意义的那些在图B和C中得到显示。D、前列腺癌诊断的单个变量的受试者操作特性(ROC)曲线。图10示出在前列腺癌的检测中一组多元尿液生物标志物优于单个PCA3。A、多变量回归分析产生包括SPINK1、PCA3、G0LPH2和TMPRSS2:ERG的多元化的模型,其对前列腺癌的预测有明显意义(参见表5)。ROC曲线上灵敏度(Sens)和特异性(Spec)的总和最大的点由虚线所表示,同时给出了阳性预测值和阴性预测值(分别是PPV和NPV)。B、和A—样,除了使用留一法交互验证(LOOCV)策略来产生曲线下的非偏倚区。
具体实施例方式当用于Oncomine数据库时(Rhodesetal.,ProcNatlAcadSciUSA101,9309[2004];Rhodesetal.,Neoplasia6,I[2004]),被称为癌症异常谱分析(COPA)的方法正确地鉴定了几种已知的致癌基因,包括白血病中的PBXl和多发性骨髓瘤中的CCNDl(Tomlinsetal.,Science310,644[2005])。另外,COPA指定ETS系基因为前列腺癌的候选致癌基因,这促进了ERG或ETVl和雄激素调控基因TMPRSS2的周期性染色体重排的发现(Tomlinsetal.,[2005],上文)。因为50-70%的前列腺癌潜藏TMPRSS2:ETS基因融合,所以进行实验以鉴定另外的前列腺癌的候选致癌基因。所执行的试验将COPA的荟萃分析(metaanalysis)用于7个前列腺癌的图谱研究并且分析了在前列腺癌中异常表达的候选物和与