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前列腺癌尿液检测试剂盒及其应用的制作方法
本发明公开了前列腺癌尿液检测试剂盒,所述试剂盒含有一步法RT-PCR扩增试剂,所述一步法RT-PCR扩增试剂含有检测PCA3和PSA的特异引物和探针,检测PCA3的引物如SEQ?ID??ID?,探针如SEQ?ID?;检测PSA的引物如SEQ?ID??ID?,探针如SEQ?ID?,该试剂盒具有操作流程简便,耗时短,结果判读简单,重复性好,复检率低,模板加入后PCR反应全程闭管,避免了污染导致的假阳性现象。
【专利说明】前列腺癌尿液检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于检测领域,具体涉及前列腺癌尿液检测试剂盒,还涉及该试剂盒的应用。
【背景技术】
[0002]前列腺癌为发生于男性前列腺组织中的恶性肿瘤,是前列腺腺泡细胞异常无序生长的结果。前列腺癌的发病率具有明显的地理和种族差异。在欧美等发达国家和地区,它是男性最常见的恶性肿瘤,其死亡率居各种癌症的第二位,仅次于肺癌;在亚洲,其发病率低于西方国家,但近年来呈迅速上升趋势。前列腺癌一般50岁以后发病,95%发生于60岁以上的老年男性,发生率随年龄增长而增加。我国每年有7
万~8万名前列腺癌新病人。而隐匿未被发现的病人数则更多。因此,凡是50岁至70岁的男性都应该定期接受前列腺癌的专科筛查;而直系亲属中有前列腺癌患者的男性,则应将筛查的时间提前到40岁。
[0003]前列腺癌在转移发生之前,早发现、及时合理治疗可有效降低该病的死亡率。前列腺癌常规筛查手段有直肠指检、血清前列腺特异抗原(PSA)测定和经直肠超声检查三种,其中,经直肠指检、血清前列腺特异抗原(PSA)测定是最基本的两项检查,一般每年检查一次;发现异常时,再行经直肠超声波检查和超声引导下的前列腺穿刺活检。
[0004]PSA(ProstateSpecificAntigen)为前列腺组织特异性抗原,由前列腺的解剖结构可知PSA通过前列腺导管进入血液和尿液中,一些病例或生理情况下PSA会进入血液中去,如前列腺炎症、尿潴留、前列腺感染、前列腺增生和前列腺癌等,因此通过检测血清PSA水平来预测前列腺癌具有一定的假阳性率。从1991年开始,检测血清中PSA含量用于预测前列腺癌,含量高于4ng/mL认为是前列腺癌阳性,灵敏度79%,特异性20%_59%,平均灵敏度约33%,在浓度4-10ng/mL灰区部·分,特异性是最低的,这时往往需要通过侵入性的穿刺活检进行确定。PSA在血液中有两种存在形式,一种与ACT结合,一种是游离状态。研究发现与良性前列腺病变相比,前列腺癌患者血清中与ACT结合的PSA含量更高一些。当检测出患者血清中
PSA含量在4-10ng/mL灰区部分时,可用游离PSA(fPSA)比总PSA(tPSA)来增加检测的特异性,可提高检测特异性约20%。
[0005]近年来发现的前列腺癌新的标记物PCA3(Prostatecancerantigen3),在前列腺癌中高表达,可反应前列腺癌进展情况。PCA3位于9号染色体,含有4个外显子,为非编码的mRNA,通过选择性剪切和多聚腺苷酸化产生至少四种不同的转录产物。RT-PCR分析显示PCA3仅在前列腺组织中表达,在其他组织中不表达。Northernblot检测分析50例患者中47例PCA3高表达,而前列腺良性病变组织中不表达或低度表达(CancerReserch,1999,Dec,I;59(23):5975_9)。文献(cancerres.,2002,Mayl;62(9):2695-8)报道比较端粒酶RNA和PCA3RNA作为前列腺癌的标记物,PCA3指示作用更优。PCA3为到目前为止针对前列腺癌特异性最优的标志物,含有4个外显子,三个内含子,Gandinietal2003等文献报道,与其它外显子相比,PCA3外显子4用于前列腺癌检测特异性最优。
[0006]Gen-probe公司开发的基于PCA3/PSA的尿液检测试剂盒,应用转录介导的扩增(TMA)方法给出PCA3/PSA在尿液中的浓度(copy/mL),然后二者相比后乘以1000即为前列腺癌风险评估值。该方法操作流程繁琐,耗时长,质控及结果判读复杂,%,跟临床常规PCR仪器不兼容,需另外购置设备。更重要的是该检测过程中需反复开盖加入试剂,易污染检测环境,导致后续检测结果出现假阳性。
[0007]基于以上几点考虑,本发明给出了一种基于PCR方法的PCA3/PSA尿液检测试剂盒,操作流程简便,耗时短,质控方法简便、结果重复性好,复检率低,模板加入后PCR反应全程闭管,避免了污染导致的假阳性现象。且使用该试剂盒用于前列腺癌预示诊断、疗效评估、复发监控准确性好,与临床评价指标符合率高。
【发明内容】
[0008]有鉴于此,本发明的目的之一在于提供前列腺癌尿液检测试剂盒,本发明的目的之二在于提供前列腺癌尿液检测试剂盒的应用。
[0009]为实现上述发明目的,提供如下技术方案:
[0010]前列腺癌尿液检测试剂盒,所述试剂盒含有一步法RT-PCR扩增试剂,所述一步法RT-PCR扩增试剂含有检测PCA3和PSA的特异引物和探针,,;,。
[0011]优选的,所述一步法RT-PCR扩增试剂还包括10XBuffer,,25MmMgCl2,DMSO分析纯;100mMDTT;UDG,逆转录酶和RNA酶抑制剂和水。各组分的用量为
10XBuffer2~10μL,~8μL,25MmMgCl2I~5μL,DMS0分析纯I~6μL;IOOmMDTTl~4μL,RocheHSTAQ(货号**********),~IμL;UDG(购自ΝΕΒ,货号ΕΝ0362),~lyL;~~2μLRNA酶抑制剂(使用Thermo逆转录试剂盒,货号K1622);引物混合物I~5μL(10μm),探针(10μm)-,更优选的,10XBuffer5yL,,25MmMgC124yL,引物混合物(10μL?),探针(ΙΟμL?),DMSO分析纯5μL;(货号**********),;UDG(购自NEB,货号EN0362),;
(其成分使用Thermo逆转录试剂盒,货号Κ1622),。
[0012]一步法RT-PCR扩增条件为:37~42°C,2_5分钟;50~60°C,15~30分钟;94~950C,10~30秒,60~65°C,10~30秒,40~50个循环,最后50度冷却30秒,最优的是37。。,5分钟;50°C,15分钟;扩增940C,10秒,60°C,30秒,45个循环,50度,30秒冷却。
[0013]优选的,所述试剂盒还包括样本运输保存液、磁珠法提取试剂、标准品、阳性质控品和阴性质控品。
[0014]更优选的,所述样本运输保存液的组分如下,质量分数
1%~5%十二烷基硫酸锂,10~20mMNaH2PO4,10~20mMNa2HPO4,~2mM乙二***~2mM乙二醇二***二***四乙酸。最优的是质量分数为3%十二烷基硫酸锂,15mMNaH2PO4,15mMNa2HPO4,ImM乙二***四乙酸(EDTA),lmM乙二醇二***二***四乙酸(EGTA),;使用时样本运输保存液和直肠指检(DRE)后的尿液样本体积比可以是1:1;1:2;1:3;1:4;1:5;2:1;3:1;4:1;5:1,最优的是1:2。
[0015]更优选的,所述磁珠法提取试剂包括捕获液和洗液,所述捕获液的组分如下:所述磁珠法提取试剂包括捕获液和洗液,所述捕获液的组分如下:100~400mMHEPES,~3MLiCl,100~500mMLiOH,50~150mMEDTA和50~400μg/mL超顺磁性的共价结合(dT)14的磁珠,所述洗液的组分如下:5~20mMHEPES,100~200mMNaCl,4~IOmMNaOH,~2mMEDTA,~%(v/v)乙醇,~%(w/v)对羟基苯甲酸甲酯,~%(w/v)尼泊金丙酯,~%(w/v)月桂醇硫酸酯钠盐。最优的,捕获液的组分如下:浓度为250mMHEPES,,310mMLiOH,lOOmMEDTA,(dT)14的磁珠;洗液的组分如下:10mMHEPES,150mMNaCl,,ImMEDTA,
%(v/v)乙醇,%(w/v)对羟基苯甲酸甲酯,%(w/v)尼泊金丙酯,%(w/v)月桂醇硫酸酯钠盐,。
[0016]磁珠法提取样本RNA:100μL~1000μL经样本运输保存液处理的尿液样本,加入I~5倍体积或1/2~1/5倍体积的捕获液,涡旋混匀1-5分钟,42~75°C反应10~60分钟,将反应液置于磁场中静置2~10分钟,吸弃液体,然后向含磁珠的EP管中加入200μL~2mL洗液,涡旋10-60秒后置于磁场中静置2~10分钟,吸弃液体,加入10~100μL的无RNase的水溶解RNA,在磁场中静置2~10分钟,将液体转移至新的EP管中,稀释O~5倍后取5μL检测。优选的,200μL经样本运输保存液处理的尿液样本加入400μL捕获液,涡旋混匀I分钟,60°C反应30分钟,将反应液置于磁场中静置2分钟,吸弃液体,然后向含磁珠的EP管中加入500μL洗液,涡旋20秒后置于磁场中静置2分钟,吸弃液体,加Λ50μL的无RNase的水溶解RNA,在磁场中静置2分钟,将液体转移至新的EP管中,稀释5倍后取5μL检测。
[0017]优选的,所述标准品为含PCA3和PSA基因片段的重组质粒。
[0018]优选的,所述阳性质控品为前列腺癌细胞株LNcap总RNA逆转录后的cDNA。
[0019]更优选的,所述阴性·质控品为正常前列腺上皮细胞株RWPE-1总RNA逆转录后的cDNA。
[0020]、治疗效果和复发监控中的应用。
[0021]本发明的有益效果在于:本发明公开了基于一步PCR方法的PCA3/PSA尿液检测试剂盒,该试剂盒操作流程简便,耗时短,质控方法简便、结果判读简单,重复性好,复检率低,模板加入后PCR反应全程闭管,避免了污染导致的假阳性现象。且使用该试剂盒用于前列腺癌预示诊断、疗效评估、复发监控准确性好,与临床评价指标符合率高。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚,本发明提供如下附图:
[0023]图1为前列腺癌尿液检测试剂盒下限检测散点图。
[0024]图2为前列腺癌尿液检测试剂盒下限检测ROC曲线。
[0025]图3为前列腺癌尿液检测试剂盒上限检测散点图。
[0026]图4为前列腺癌尿液检测试剂盒下限检测ROC曲线。
[0027]图5为PCA3标准曲线。
[0028]图6为PSA标准曲线。
[0029]图7为前列腺癌尿液检测试剂盒检测散点图。[0030]图8为前列腺癌尿液检测试剂盒检测ROC曲线。
【具体实施方式】
[0031]下面将结合附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如分子克隆实验指南(第三版,J-萨姆布鲁克等著)
中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0032]实施例1试剂盒检测试剂、检测条件下限检测能力
[0033]:包括样本运输保存液、磁珠法提取试剂、一步法RT-PCR扩增试剂、标准品、阳性质控品、阴性质控品。
[0034]样本运输保存液:成分为质量分数为1%十二烷基硫酸锂,IOmMNaH2PO4,IOmMNa2HPO4,***四乙酸(EDTA),***二***四乙酸(EGTA),;
[0035]磁珠法提取试剂:
[0036](I)捕获液:浓度为IOOmMHEPES,,IOOmMLiOH,50mMEDTA和50μg/mL超顺磁性的共价结合(dT)14的磁珠(~,Sera-Mag?),;
[0037](2)洗液:5mMHEPES,IOOmMNaCl,4mMNaOH,,%(v/v)乙醇,
%(w/v)对羟基苯甲酸甲酯,%(w/v)%(w/v)月桂醇硫酸酯钠盐,。
[0038]磁珠法提取样本RNA:100μL经样本运输保存液处理的尿液样本加入20μL捕获液,涡旋混匀I分钟,42°C反应1·0分钟,将反应液置于磁场中静置2分钟,吸弃液体,然后向含磁珠的EP管中加入200μL洗液,涡旋10秒后置于磁场中静置2分钟,吸弃液体,加入10μL的无RNase的水溶解RNA,在磁场中静置2分钟,将液体转移至新的
EP管中,取5μL检测。
[0039]一步法RT-PCR扩增试剂,包括2μL10XBuffer,,
IμL25MmMgCl2,1μLPCA3和PSA弓丨物混合物(引物浓度分别为10μm,具体序列如下:PCA3上游引物5’-ccaggaagatctgcatggtggg-3’();PCA3下游引物5,-gatgacccaagatggcggc-3,();PSA上游引物5,_cctgctcgggtgattctg_3,();PSA下游引物5,-gccacgatggtgtccttgat-3,()),(PCA3探针:5’-gcacagagatccctgggagaaatgcc-3’();PSA探针:5,-gggcccacttgtctgtaatggtgtgc_3’(),DMSO分析纯IμL;IOOmMDTT,IμL;(货号**********),(购自NEB公司,货号ΕΝ0362);(其成分使用Thermo逆转录试剂盒,货号Κ1622),。
[0040]一步法RT-PCR反应条件:37°C,5分钟;50°C,15分钟;94°C,5分钟;扩增94°C,10秒,60°C,30秒,45个循环,最后50°C冷却30秒。
[0041]标准品:以前列腺癌细胞株LNcapIygSRNA逆转录后的cDNA为模板,