制备共轭亚油酸的方法.docx

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专利名称:制备共轭亚油酸的方法
技术领域:
本发明涉及制备共轭亚油酸的方法。具体地,本发明公开了通过有益细菌从谷物制备共轭亚油酸,特别是其顺式-9,反式-11异构体的方法。
背景技术:
CLA是共轭亚油酸的不同异构体的通称,在这些异构体中只有两种异构体(顺式-9,反式-11异构体,即牛酸,和反式-11,顺式-12异构体)被发现具有生物活性。合成的CLA产品可通过商业途径得到,但是这些产品通常包括CLA的所有不同异构体并且只有40%c9,t11异构体。此外,动物产品(如肉和奶)可被用作CLA来源。这些产品的一个益处是它们所含有的CLA大多数是c9,t11异构体,例如,奶CLA含有80%的c9,t11-18∶2异构体。
一些研究表明动物脂肪含有能在试验动物中防止癌症、影响生长因子并可以调节身体脂肪组织的量的脂肪酸。当研究汉堡牛排时,MichaelPariza发现它们包含经分析为共轭亚油酸(CLA)的脂肪酸。在试验动物上进行的研究中发现与对照组相比,在用含有CLA的食物饲养的组中乳腺癌、胃癌和大肠癌的发生率降低(Pariza,.,Loretz,.,Storkson,,,
CancerRes.(Suppl.)432444-2446,和Pariza,,和Hargraves,,12-二***-593))。CLA还能够抑制人细胞的组织培养物中癌细胞的发育。作用的模式仍然未知,但是已经发现CLA对癌的不同发育阶段、一些生长因子和可能地对肝脏中致癌物质的代谢具有影响。此外,CLA被提示还可以发挥抗氧化剂的功能(Ip,C.,Chin,.,Sci-meca,.,和Pariza,-6124),在这种情况下,该化合物将保护细胞膜免受自由基的不利影响。此外,已经研究了该化合物对胆固醇水平的降低作用,并且已经发现该化合物不像胆固醇降低药物那样降低好HDL的量(Lee,.,Kritchevsky,D.,和Pariza,-25)。CLA可能还帮助体重观察者,因为已发现该化合物分解脂肪组织(Park等,,243-248)。
已发现非共轭亚油酸具有不利影响,如对乳腺癌的刺激作用。通常还公知非共轭亚油酸的抗微生物作用。
可以通过化学方法或酶学方法通过异构化亚油酸制备CLA。天然CLA从例如多不饱和的脂肪酸形成,是细菌溶纤维丁酸弧菌
(Butyrivibriofibrisolvens)在反刍动物的瘤胃中的细菌作用的结果,CLA从瘤胃中分泌到奶和肉中,它们是已发现的最好的CLA来源。
已经注意到在过去十年中从食物得到的CLA的量已经大量降低。在食物成分分析中计算出在20世纪70年代,。由于奶和奶产品的使用下降,。在食物中增加天然CLA的量对于公共健康是非常重要的,因为根据研究,CLA摄入加倍将降低例如癌症的危险。
对于食品,在一些研究中强调了奶作为CLA来源的重要性。例如,根据芬兰人口统计学研究(Knekt等,口头交流),奶的使用降低了乳腺癌的危险。现在奶脂肪的CLA含量根据饲养质量而周期性地发生相当大程度(-)的变化。
已经发现肠道有益微生物形成CLA。具体地,研究了瘤胃细菌溶纤维丁酸弧菌及其异构酶。然而,该细菌对厌氧条件的要求如此之高以致通过该细菌工业规模生产CLA是不可能的,因为安排该菌株所需的严格厌氧条件是困难和不经济的(US5,856,149,Pariza等)。
已发现Propionibacteriumagnes种也形成CLA,但是该病原性菌株也产生还原酶,其将产生的CLA还原成其他脂肪酸(Verhulst等,(1987)12-15)。
还通常知道一些丙酸细菌能够将亚油酸转变成其共轭的顺式-9,反式-11的形式。此外,公知游离的亚油酸转变成CLA比甘油三酯脂肪酸的转变更有效。然而,游离的亚油酸对已经是相对小浓度的丙酸细菌具有生长抑制作用,这迄今为止阻碍了共轭亚油酸特别是其顺式-9,反式-11形式的大规模生产。
美国专利5,856,149,Pariza和Yang,描述了通过卢氏乳杆菌(Lactobacillusreuterii)菌株,(9位和12位的双键)脂肪酸来生产顺式-9,反式-11脂肪酸的方法。该出版物描述了CLA-生产菌株的分离并且陈述仅仅4/45的分离的菌株具有想要的亚油酸异构酶活性,即,这些菌株能够从亚油酸生产CLA。该出版物没有提到游离亚油酸对细菌生长的抑制效果,其也没有提出避免该问题的技术方案。
在通过日常起始培养物生产共轭亚油酸方面,(1998),-102,,。已经注意到成熟干酪含有比其他奶产品更高的CLA量,Jiang等研究了19种不同的起始细菌将加到培养基中的亚油酸转变成CLA的能力。他们研究了7种乳杆菌(lactobacillus)菌株、4种乳球菌(lactococcus)菌株、2种链球菌(streptococcus)菌株和6种丙酸细菌在MRS、奶和乳酸钠培养基上将亚油酸转变成
CLA的能力。此外,通过将亚油酸以Tween80去污剂的水性溶液形式加入MRS肉汤研究了不同亚油酸浓度。所分析的细菌中只有少许丙酸细菌显示出生物转化活性;6种菌株中的3种显示出活性,即费氏丙酸杆菌费氏亚种()PFF和PFF6和费氏丙酸杆菌谢氏亚种()PFS。使用PFF6菌株从750μg/ml的最初亚油酸浓度得到了265μg/ml的CLA的最大产量。产生的CLA含有70到90%生物活性c9,t11异构体。没有发现乳杆菌、乳球菌和链球菌产生CLA。
从而,通过Jiang等描述的技术,最好的丙酸细菌PFF6菌株只能够将35%所加入的亚油酸转变成CLA。研究人员发现丙酸细菌的CLA生产与它们对游离亚油酸的耐受性正相关。因此,该研究证实了亚油酸具有抑制细菌生长的抗微生物作用这一公知事实。该出版物陈述可通过使用表面活性剂,如去污剂,例如Tween80,或者蛋白质减少此抗微生物的脂肪酸的效果。然而,这些研究还没有进行并且出版物也没有公开过可行的、有用的技术。
WO99/29886,,。该申请涉及一些在食品应用中有用的细菌在CLA的体外生产中的用途。除了费氏丙酸杆菌费氏亚种和费氏丙酸杆菌谢氏亚种,提到短双歧杆菌
(Bifidobacteriumbreve)是适宜的细菌。根据该出版物,可在乳化剂,如Tween80和卵磷脂的存在下进行发酵。但该出版物的实施例没有描述乳化剂的使用,并且得到的最佳结果与上面提到的文章中的结果相同使用PFF6菌株从750μg/,t11异构体。从而,产率低于33%。
芬兰专利88856描述了制备含有活的微生物并且主要基于燕麦麸的发酵食品的方法。燕麦麸或就此发酵或热处理后发酵,并且乳酸细菌,尤其是嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)被用作微生物。在该出版物中描述的发明目的是在新食品种类中利用燕麦的高纤维含量。作为实例,该出版物给出了酸乳酪型点心。该出版物没有提到亚油酸或从其生产的共轭亚油酸。
因此,仍然清楚地需要生产共轭亚油酸的新方法。当CLA通过微生物方法制备时,基本的是如何最小化或避免与外部亚油酸的毒性和抗微生物作用相关的问题。此外,也非常欢迎在CLA生产中可以利用新的原材料的方法。
发明简述本发明基于谷物作为亚油酸来源的用途。对于不同谷物种类,燕麦被认为是优选的亚油酸来源。
从而本发明涉及从亚油酸制备共轭亚油酸(CLA)的方法,该方法利用包括亚油酸的谷物作为亚油酸来源。
本发明的方法优选包括两个步骤,其中谷物脂肪被水解以从中释放亚油酸和释放的亚油酸通
过微生物被异构化成共轭亚油酸。
本发明还涉及谷物在共轭亚油酸的制备中的用途。
本发明还涉及通过本发明方法制备的产品和它们的就此使用或在功能性物质制备中的用途。
发明详述通过微生物制备共轭亚油酸的本发明方法的特征是包括亚油酸的谷物脂肪被水解并且水解释放的亚油酸通过微生物被异构化成共轭亚油酸。
从而本发明的基础在于应用谷物作为亚油酸的来源。根据本发明,通过脂肪的水解反应从谷物释放亚油酸。与本发明相关的,已经令人惊奇地发现当谷物材料用作本申请中描述的亚油酸来源时,亚油酸不抑制异构反应。当谷物,特别是燕麦被用作起始材料时,可以保证在异构化的整个过程中微生物都可以得到亚油酸,而亚油酸不妨碍细菌行使功能。
用作来源材料的谷物可以是含有亚油酸并且适于用作可食用产品的起始材料的任何谷物。燕麦、大麦、黑麦、小麦和从它们制备的麦芽可被作为实例提及。适宜的原材料包括未处理的和处理的谷物和从它们制备的级分。
根据本发明,燕麦是最优选的起始材料。燕麦的亚油酸含量是干固体物质的约2到4%,并且大多数亚油酸结合到甘油二酯和甘油三酯。燕麦还含有脂肪酶,其将甘油二酯和甘油三酯降解成游离脂肪酸。考虑本发明的目的,燕麦由于其高的亚油酸含量和天然的脂肪
酶活性而是有利的原材料。
谷物,特别是燕麦的天然脂肪酶活性可用于脂肪的水解反应。该反应所需要的酶活性也可以从外部加入。对于燕麦和特别是其他谷物,根据需要向反应中加入脂肪酶可以提高CLA产率。
通过预处理也可以促进燕麦脂肪或其它谷物的脂肪的酶促水解。一种有利的预处理方法是制麦芽(malting),其可被用于在谷物中产生脂肪酶活性。其他适宜的预处理包括碾碎、碾磨、粉碎和溶于适宜的溶剂,特别是溶于水或其它液体介质。
燕麦的脂解,例如,可以通过碾碎燕麦谷粒并将水加入碾碎的燕麦中启始。脂解中形成的游离亚油酸部分地结合到燕麦的其他组分上,这减少了异构化反应可以得到的亚油酸的量,因此应该加以避免。
可通过选择适宜的反应条件减小或甚至消除该问题。在条件的选择中,最必要的是防止燕麦材料的特征性pH降低,这可通过在亚油酸异构化步骤中使pH保持在足够高的水平来实现。
适宜的pH为例如,。优选地,,。该pH调节可以防止亚油酸结合到燕麦物质上,这似乎对异构化反应具有有利的影响。重要的是,异构化混合物中pH的降低由燕麦物质本身而不是由发酵导致。因此,异构
化反应不需要常规发酵,即酸化,但是其涉及生物转化。异构化反应中形成的多数CLA为顺式-9,反式-11异构体。
根据本发明(从燕麦)释放的亚油酸用于CLA生产。异构化反应可通过例如化学方法、酶学方法或微生物学方法进行。亚油酸转变成CLA优选通过微生物学方法进行。在生物转化中,可以使用能够将亚油酸转变成CLA的任何细菌,如在上面的发明背景描述中提到的细菌。然而,异构化优选通过适于食品中使用的有益细菌,尤其是通过丙酸细菌进行。例如,属于费氏丙酸杆菌,尤其是属于费氏丙酸杆菌费氏亚种和费氏丙酸杆菌谢氏亚种的菌株是适宜的。
异构化以本身已知的方式进行。根据所用菌株的要求选择异构化混合物的组分和条件以便得到最佳CLA产率。
本发明公开后,适宜的反应参数的选择是本领域技术人员技术的一部分。
脂肪水解和异构化步骤可以平行地,即同时地,或者在不同容器或同一容器中顺序地进行。在一个容器中两步骤的同时进行由于方法简单而被认为是有利的备选方案。
在一个尤其优选的实施方案中,有益细菌,优选丙酸细菌被加到碾磨的燕麦中,在这种情况下脂解中释放的亚油酸直接与有益细菌反应,该细菌将亚油酸异构化成共轭亚油酸。通过调整过程条件以适于脂解和异构化反应,可以在混合物中形成大量
CLA。水或其它适宜的介质,尤其是液体介质,可用于方便混合。与本发明相关,例如,水已经被用作介质从而燕麦混合物中干固体含量为5%,在这种情况下燕麦干固体的约1%以及燕麦脂肪的约10%形成了CLA。
通过将谷物性质和能够在异构化反应中作为异构化催化剂的细菌的应用相联合,可以避免与CLA生产相关的两个最大的问题亚油酸的毒性和其在水中的难溶性。优选将CLA生产菌株的能力与这样的材料联合,所述材料含有亚油酸和脂肪酶并且可以无需其他添加物以研磨形式为CLA生产提供亚油酸。谷物中的这种材料是燕麦。当使用没有脂肪酶活性的材料,如小麦时,可以加入外来脂肪酶活性或通过制麦芽形成脂肪酶活性。根据本发明,可以避免使用为“溶解”外部亚油酸所需的去污剂或其他有害添加剂。
根据本发明制备的含有CLA(燕麦)的细菌混合物可以就此使用,其可以被加入并在食品或类似的功能性产品的制备中使用,并且可从中分离出各种含有CLA的级分。CLA形成也可以与食品的制备同时发生。当形成不同产品时,CLA、有益细菌和/或谷物如燕麦的功能性性质可以以想要的方式在产品中应用。
其中将共轭亚油酸从异构化混合物中分离出来的实施方案被认为是优选的实施方案。当要利用共轭亚油酸和细菌细胞的功能性作用时,它们可以一起被回收、浓缩和可能地干燥或冻干。当水被用作介质时,通过降低