制备uk-61,689的微生物学方法及所用的微生物的制作方法.docx

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专利名称:制备uk-61,689的微生物学方法及所用的微生物的制作方法
技术领域:
本发明涉及制备UK-61,689的微生物学方法,它包括在液体营养培养基中,最好在深层通气条件下培养玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC53,666的突变株。UK-61,689是一种有价值的酸性多环醚抗生素和强抗球虫剂。本发明特别涉及得自玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC53,666的突变株ATCC53,674和53,665,其特征在于它们能在产生UK-61,689的同时产生UK-58,852;涉及ATCC53,665的一个突变株,其特征在于它能在产生UK-61,689时基本上不产生UK-58,852,所述突变株具有玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC53,664的鉴定特征。
产生UK-61,689和UK-58,852的微生物是从玫瑰红黄马杜拉放线菌的一个称为FD-27684(ATCC53,666)的新菌株突变而得到的,该新菌株是从采自日本镰本山江村(YamaeVillage,Kamamoto,Japan)的土壤样品中分离的。
用N-***-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)作为诱变剂,然后考察经处理微生物的单菌落的UK-61,689的产生。一般的步骤包括在28℃下,在深层好气条件下在液体营养培养基中振荡培养ATCC53,666。生长阶段培养基的选择并不重要。培养基中含有西瑞糖()、玉米淀粉()、玉米浆()NZAmineYTT(
克)(酪蛋白酶解物的注册商标,HumkoSheffield化学公司)、***化钴(),将该培养基悬浮在1升水中,,分装(800毫升)到一个费氏烧瓶中。高压灭菌后,用斜面生长悬浮液或冻干的营养菌丝体接入瓶中,而后在约200转/分的摇床上28℃下振荡培养8天。然后取出50毫升样品,菌丝体用特***隆杵组织研磨器匀浆,随后再进行超声波断裂。离心断裂的菌丝体,洗去培养液,再悬浮在装有50毫升新鲜培养液的300毫升三角瓶中,在32℃下摇瓶培养2小时,然后再离心细胞,用无菌水洗去培养液,(羟***)氨基甲烷-苹果酸缓冲液中。各份悬浮液再在34℃下,在250-300转/分的旋转水浴摇床上,用浓度为每毫升750-1500微克的诱变剂NTG处理1小时。离心处理后的细胞,用无菌水洗去诱变剂,并悬浮于装有新鲜生长培养基的三角瓶中,32℃下在200转/分的柜式摇床上振荡培养。3天后,对生长良好的菌丝体作匀浆和超声处理。对每份超声过的菌悬液进行逐级稀释并涂在固体营养培养基上,平皿在28℃下进行培养,直到菌落形成单位的大小足以转接到斜面上为止。一种适合于平皿和斜面的培养基是N-ZAmineTypeA(HumkoSheffield化学公司)。使接种后的斜面在28℃生长10-14天,而后就可以用作试验了。该试验是接种300毫升三角瓶中装有的25毫升合适培养基
(这样一种培养基含有西端糖,;黄豆粉,;玉米浆,;MnSO4·H2O,;MgSO4·7H2O,;***化钴,;碳酸钙,;水1升,)。121℃高压灭菌30分钟后,用斜面生长悬浮液分别接入三角瓶中,在NewBrunswick摇床上,28℃振荡培养7天。为检测突变株培养物FD-28454(ATCC53,674),使用所收集的全培养液经***异丁***抽提,薄层层析(硅胶)展层后用香草醛试剂喷层析板,在100℃下加热5分钟后进行考察。展层系统为9份***仿与1份甲醇,在该系统中,UK-61,,UK-58,。这样获得的突变株培养物产生UK-61,689和UK-58,852的混合物。UK61,689与UK58,852的比例变化在某种程度上似乎取决于发酵条件。所得突变株的形态和培养特征基本如本文所述的玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC53,666。该突变株的不同特征在于它能产生UK-61,689和UK-58,852的混合物,其中UK-61,689是主要产物。突变株的培养和UK-61,689抗生素的分离可在与以前发酵生产聚醚类抗生素所用的相似条件下进行。参见例如美国专利4,361,649。最好采取在24-36℃温度下,用液体营养培养基在深层搅拌通气条件下进行培养。培养用营养培养基包括可同化的碳源,如糖、淀粉和甘油;有机氮源,如酪蛋白、酶解酪蛋白、黄豆饼、棉籽饼、花生饼、麸皮、豆粉、肉粉、鱼粉。生长物质的原料如可溶性谷物、鱼粉、棉籽粉、酵母浸
汁,还有无机盐,如***化钠、碳酸钙,以及微量元素如铁、镁、铜、锌、钴和锰也可以加以利用而产生有益的结果。发酵中如果泡沫过多,可向发酵培养基中加入诸如植物油或硅***等消沫剂。-2个体积。可用发酵领域技术人员一般熟知的搅拌装置来维持搅拌。搅拌的速度根据所用搅拌器的类型而定。摇瓶的转速通常是每分钟150-300转,而发酵罐则通常为每分钟300-1700转。当然必须在接种和整个生长过程中保持无菌条件。
制备本发明抗生素所用的接种物可以使用培养物的斜面生长物或用该培养物或该培养物的冻融的菌丝体悬浮液接种的Roux瓶。一种适于菌株最初在斜面和Roux瓶上生长的固体培养基是ATCC172号培养基。前面提到的突变研究用的液体培养基也适于在冻干前制备营养菌丝体。生长物既可用来接种摇瓶,也可用来接种种子罐,也可用摇瓶作为种子罐的种子。摇瓶中达到最大生长通常需4-8天,而深层接种罐中的接种物通常在最适合的时间4-5天内达到最大生长。
发酵期间抗生素产物的积累可以用薄层色谱法在如前述用香草醛试剂喷雾显迹后进行定性检测。也可以将展层后的薄层板铺以接种枯草杆菌(Bacillussubtilis)的脑心浸汁琼脂,在37℃下培养16小时后观察抗生素。薄层色谱也是发酵液中抽提的粗制品和纯制品组成分析的有用工具。一种应用
10厘米×-18微孔柱,***/甲醇(40/200/760)的高压液相色谱法,用折光率检测器可以定量测出发酵液中UK-61,689和一同产生的UK-58,852的量。
由本文所述的突变株发酵产生的抗生素UK-61,689,在菌丝体和发酵液中积累,并可通过抽提所收集的全部未经过滤的发酵液来分离和回收,即用有机溶剂如***仿、乙酸乙酯、***异丁***或丁醇在自然pH下抽提全发酵液。为了避免严重的乳化问题,也可分离出菌丝体,将菌丝体和澄清的发酵液分别用有机溶剂抽提。然后有机溶剂抽提液浓缩至稀浆状,用色谱法得到纯的UK-61,689。
一种典型的分离和回收抗生素的方法如下用***异丁***抽提突变株发酵得到的全发酵液。真空蒸发抽提液,得到浅红色油状物,把它溶于乙酸乙酯中,而后倒在硅胶柱上,用乙酸乙酯洗脱硅胶柱,洗脱物用薄层色谱法进行检测。合并含有UK-61,689的组分并蒸发至干。由此得到的UK-61,689可以用异丙醚结晶而进一步纯化。
UK-61,689可以用已知方法把菌丝体发酵所得的全发酵液蒸发而回收,这些方法包括喷雾干燥或过滤或离心而从发酵液中分离菌丝体。这样得到的菌丝体产物在菌丝体表面和菌丝体间含有UK-61,689,使得菌丝体成为UK-61,689的良好载体。
按上述制备FD-28454(ATCC53,674)的方法,取上述突变株FD-28454的单菌落分离株(称为FD-28474)本身进行NTG诱变处理。用这一方法得到另一个突变株(FD-28499),该菌株具有玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC53,666的形态和培养特征,当然,也具有第一个产生的突变株的形态和培养特征。然而这个突变株(FD-28499)不同于突变株FD-28454和FD-28474,即它只产生UK-61,689而基本上不产生(即<1%)UK-58,852。用与培养首先描述的突变株(FD-28454)相同的方法培养突变株FD-28499,用上述方法从发酵液中回收UK-61,689。
最后一个突变株(由Pfizer公司培养物收集处鉴定为FD-28499)、突变株FD-28454和FD-28474及起始微生物FD-27684,均已按布达佩斯条约的有关条款保藏在美国典型培养物保藏中心(Rockville,Maryland),该中心是公认的提供永久保藏的保藏机构,一旦本申请被授予专利,公众就可以索取。这几个菌株分别定名为玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC53,664、ATCC53,674、ATCC53,665和ATCC53,666。在本申请未决期间,。对公众索取保藏微生物的所有限制,都将在对该微生物授予专利后不可改变地取消。
-27684、FD-28474及FD-28499的分类学研究,他提供了下列描述。
将每一种斜面培养物接种到ATCC172号培养液中,在28℃下摇床培养4天。然后离心20分钟,用无菌蒸馏水洗三次,再接种到鉴定放线菌常用的培养基上。
在28℃下培养这些培养物,在不同时间记录结果,但最经常的是在第14天记录。使用常用术语描述颜色,但确切的颜色用ColorHarmonyManual(第4版)的踅斜冉侠慈范āH赴基酚分析方法为Becker等人所述的方法(.,12421-423,1964)。全细胞糖分析利用Lechevalier(-944,1968)及Staneck和Roberts(.,28226-231,1974)的方法。用玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC39,697的典型培养物作对照。
-(ISP1号培养基,Difco公司)。
-麦芽汁琼脂-(ISP2号培养基,Difco公司)。
-(ISP3号培养基,Difco公司)。
-淀粉琼脂-(ISP4号培养基,Difco公司)。
-天冬酰***琼脂-(ISP5号培养基,Difco公司)。
-酵母浸汁铁琼脂-(ISP6号培养基,Difco公司)。
-,,1号培养基,,1961。
-天冬酰***琼脂-同上,2号培养基,。
-同上,30号培养基,。
-同上,28号培养基,。
-同上,14号培养基,。
-,-150,1955。
-同上。
-,-29,1957。
-,-27,1957。
-同上。
***盐液体培养基-同上。
***盐液体培养基-,TheActinomycetes,,1号培养基,,1961。用3克葡萄糖代替30克蔗糖,不加琼脂。
-,.,71934-944,1968,但只用30克马铃薯,。
%琼脂。
-.,ProblemsintheClassificationofAntagtonisticActinomycetes,.,,1957。
-同上。
-Difco公司。
-(a),-248,1930.(b),ACompilationofCultureMedia,2511号培养基,1930。
-.,-63,1974。
-同上。
-同上。
、次黄嘌呤、黄嘌呤和尿素-同上。
-同上。
-C-2培养基,,-894,1971。
-ATCC172号培养基,ATCCCultureCollectionCatalogue,15thed.,,1982。FD-27684培养物的描述酵母浸汁-麦芽汁琼脂生长良好,粉红至红色(61/2ia,7ia,6ia),隆起,皱折,长有白色气丝;反面红色(7ia);无可溶性色素。
燕麦粉琼脂生长中度,奶油色(2ca),略隆起,光滑或出现单菌落;无气丝或气丝稀少,白色;反面奶油色
(2ca);无可溶性色素。
无机盐-淀粉琼脂生长弱至中度,无色至奶油色(2ca),稀薄,光滑;无气丝或气丝稀少,白色;反面颜色同表面;无可溶性色素。
甘油-天冬酰***琼脂生长弱至中度,奶油色(2ca),带粉色至红色斑点(6ea,61/2ga);无气丝或气丝稀少,白色;反面无色至奶油色(2ca),带红色斑点;无可溶性色素。
蔗糖察氏琼脂生长弱至中度,奶油色(2ca),带粉色至红色斑点(5ea,
);无气丝或气丝稀少,白色;反面无色至奶油色(2ca);无可溶性色素。
葡萄糖一天冬酰***琼脂生长中度至良好,粉色至红色(
),隆起;光滑,颗粒至皱折;气丝白色至浅粉色(6ea);反面红色(
);浅淡黄色(3ca)可溶性色素。
高尔登—史密斯氏酪氨酸琼脂生长中度至良好,粉—橙色(5ea),中度隆起,皱折;无气丝或气丝稀少,白色;反面颜色同正面;浅黄色(2lc)可溶性色素。
苹果酸钙琼脂生长贫乏,无色,稀薄,光滑,无气丝;反面无色;无可溶性色素。
酪蛋白琼脂生长中度至良好,粉一橙色至橙色(4ia,5ia),中度隆起,皱折,无气丝;反面浅黄至淡粉色